Получение мутантов Burkholderia cenocepacia с измененной способностью к формированию биопленок и их характеристика in vitro и in vivo

• Автор: Андреев, Александр Львович
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 112 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Биоиленки феномен, история вопроса.

Глава 2. Методы исследования бионленок

2. 1. Микроскопические методы

2. 2. Генетические методы

Глава 3. Характеристика бактерий рода i

Глава 4. Генетический контроль процесса образования биопленок

4. 1. Роль регуляторной системы i в образовании биопленок

4. 2. Стадии процесса образования биопленок и их генетический контроль

Глава 5. Роль клеточных структур в формировании биопленок.

Глава 6. Значение биопленок в патогенезе хронической инфекции
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Глава 7. Материалы и методы.
7. 2. Световая микроскопия.
7. 3. Полимеразная цепная реакция ГП i
7. 4. Инсерционный мутагенез.
7. 5. Анализ формирования биопленок
7. 6. Выделение ДНК, клонирование
7. 7. Протеомный анализ
7. 8. Трансмиссионная электронная микроскопия
7. 9. Заражение лабораторных животных
7. . Статистическая обработка результатов
Глава 8. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
8. 1. Получение мутантов с нарушенной способностью к образованию
биопленок
8. 2. Идентификация генов, принимающих участие в образовании
биопленок
8. 3. Протеомный анализ штамма 0 и полученных мутантов.
8. 4. Сравнительное морфологическое изучение мутантных штаммов.
8. 5. Сравнительная характеристика инфекционного процесса, вызванного
мутантными штаммами В. ii
8. 6. Патоморфологические исследования.
легких инфицированных мышей
Глава 9. ОБСУЖДЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
ЛИТЕРАТУРА


Идентификацию полученных мутаций проводили после клонирования фрагментов мутантных генов по маркеру пласпозона, секвенирования клонированных фрагментов и сравнения полученных сиквеисов с имеющимися в базах данных нуклеотидными последовательностями геномов. Для характеристики полученных мутантов использовали метод протеомного анализа синтезируемых ими белков. На основе комплексного подхода при исследовании процесса формирования биопленок бактериями В. и , кодирующие глобальные регуляторы транскрипции, и геи , кодирующий субъединицу I цитохром убихинол оксидазы. Впервые для В. Впервые, при использовании протеомного анализа, показана дифференциальная экспрессия белка шаперона у штаммов с различной способностью к образованию биопленки. Это дает возможность предполагать роль этого белка в генетическом контроле процесса формирования биопленок бактериями В. Выявлена наиболее чувствительная к инфекции В i линия мышей I, позволяющая, проводить сравнительные исследования динамики инфекционного процесса, вызываемого различными штаммами этого возбудителя. С использованием этой линии мышей впервые экспериментально показана зависимость более длительной персистенции бактерий В. Впервые при проведении гистопатологических исследований легких мышей, инфицированных штаммом с повышенной способностью к образованию биопленки, на поверхности альвеол наблюдали окрашенную эозином биопленку. Полученные результаты подтверждают, что способность к образованию биопленок у бактерий В. Медицинская микробиология и клиническая фармакология, к сожалению, только начинают подбираться к разработке современных медикаментозных препаратов с целью их воздействия на биопленки. Однако, в бактериологических лабораториях развитых стран уже начинают оценивать антисептики и антибиотики по эффективности их действия не только на изолированные микроорганизмы, но и на бактерии, находящиеся в составе биопленок. В. i с различной способностью к образованию биопленок, в применении комплекса методов и подходов для характеристики полученных мутантов i viv и i vi, что позволит оценивать степень влияния различных лекарственных средств на этот процесс и на способность образовывать биопленки различными видами бактерий. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. Долгое время господствовало общепринятое представление, что в природных условиях бактерии живут в виде свободноплавающих планктонных клеток, например в поверхностных слоях морских или речных вод, хотя тот факт, что бактерии способны образовывать сложные бактериальные сообщества, микробиологам был известен еще со времен А. Левенгука Ильина, Романова, Гинцбург, . Способность к образованию биопленок в последние годы была обнаружена более чем у видов бактерий Веселова, . Прогрессу в понимании феномена биопленок способствовало совершенствование техники микроскопирования и особенно применение конфокального сканирующего лазерного микроскопа КСЛМ, позволившее изучать микроструктуру живых биопленок , . , . Биопленки это высокоорганизованные бактериальные сообщества, образованные бактериями одного или нескольких видов и состоящие как из активно функционирующих клеток , . , , . . , . Ряд авторов , . v, , i, считают образование биопленок морфологической дифференциацией в ответ на воздействие факторов внешней среды, таких как изменение температуры, среды, осмолярность, что сопровождается изменением метаболизма, гидродинамики, коммуникативных связей и г. Сложная архитектура биопленок обеспечивает возможность метаболической кооперации клеток внутри пространственно хорошо организованных систем, создает условия, благоприятствующие установлению симбиотических взаимоотношений между бактериями разных видов и защите от воздействия внешней среды. Биопленки пронизывает сеть водных каналов, обеспечивающих доставку питательных веществ членам сообщества и удаляющих продукты метаболизма. Образование биопленок является сложным многошаговым и строго регулируемым биологическим процессом.