Получение и изучение свойств протеазы, синтезируемой Bacillus subtilis

• Автор: Хазиев, Артур Фатыхович
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 122 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Протеолитические ферменты бактериальной природы, методы получения и очистки

Глава 2. Способы стабилизации ферментов и сфера их применения СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Глава 3. Объекты и методы исследований

3.1. Объеюы исследований

3.2. Методы исследований

Глава 4. Разработка способа микробного биосинтеза протеолитического фермента

4.1. Изучение влияния компонентов питательной среды на рост и продукцию протеазы

4.2. Исследование протсазосинтетичсской активности i ii ЗН

4.3. Масштабирование процесса культивирования и биосинтеза протеолитического фермента штаммомпродуцентом i ii ЗН Глава 5. Разработка способа очистки протеолитического фермента i ii 3 Н

5.1. Очистка протеолитического фермента, полученного в питательной среде с пептоном

5.2. Очистка протеолитического фермента, полученного в питательной среде с дрожжевым экстрактом и мочевиной
Глава 6. Получение стабильных форм протеолитического фермента
6.1. Иммобилизация протеолитического фермента на полиглюкине
6.2. Образование внутримолекулярных сшивок глютаровым альдегидом
6.3. Изучение стабильности нативного, иммобилизованного на по
лиглюкине и сшитого глютаровым альдегидом протеолитического фермента
Глава 7. Изучение свойств различных форм протеолитического фермента
7.1. Влияние величины на протеолитическую активность
7.2. Определение субстратной специфичности
7.3. Изучение кинетики протеолиза
7.4. Изучение температурного оптимума
7.5. Молекулярная масса
7.6. Ингибиторный анализ
7.7. Изучение раноочищающего и ранозаживляющего действия протеолитического фермента
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Экспериментально доказана раноочищающая и ранозаживляющая активность полученного протеолитического препарата. Выход протеолитического фермента, полученного по этой технологии, достигает не менее , а его удельная активность составляет, не менее ПЕмг белка. Оптимизирован процесс периодического глубинного гомогенного культивирования высокоактивных клонов штамма i i i ЗНУ продуцирующего протеазу, с использованием мочевинодрожжевой питательной среды и рациональной схемы подготовки посевного материала. Подобраны условия выделения, очистки, иммобилизации и стабилизации протеазы, обеспечивающие получение препарата с высокой удельной протеолитической активностью. Очищенный стабилизированный протеолитический фермент является металлопротеазой с широким оптимумом величины , температуры, а также обладает в опытах i viv раноочищающим и ранозаживляющим действием. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. Известно, что бактерии являются важнейшими объектами современной биотехнологии, как продуценты самых разнообразных биологически активных веществ. Среди них споровые бактерии являются наиболее продуктивными микроорганизмами. Их используют для получения ферментов, антибиотиков, инсектицидов, и т. Ферментам микробного происхождения принадлежит большое будущее в перспективном создании лекарственных препаратов , . Микробные протеазы делятся на три класса щелочные, нейтральные и кислые, которые имеют оптимумы активности при щелочной, нейтральной или кислой реакции среды, соответственно . Существует классификация протеаз, основанная на строении их активных центров, при этом выделяют четыре группы сериновыс, металло, цистеиновые и аспартатные протеазы 4. Их можно разделить по чувствительности к различным ингибиторам 3. Сериновыс протеазы ингибируются фенил метилсульфонилфлуоридом и диизопропилфторфосфатом I, металлопротеазы хелатирующими агентами, цистеиновые ферменты йодацетамидом и тяжелыми металлами, а аспартатные протеазы пепстатином. В смеси протеаз эти ингибиторы позволяют измерять активность фермента каждого класса без предварительной очистки 3. Данные литературы свидетельствуют о том, что штаммы i секретируют металло и сериновые протеазы, в то время как кислые протеазы грибы и высшие эукариоты 3. В г. . 9 выделил электрофоретически гомогенный препарат нейтральной протеазы из культур i ii. Фермент был получен в кристаллическом виде. Нейтральная очищенная протеаза i ii имела оптимум в диапазоне от 6,5 до 8,0 при проведении всех стадий очистки при 4 С в присутствии ионов кальция 7. Из i ii v. В качестве продуцентов протеаз использовались i ii, i iii и i i 8, 0, 3 i , i i, i x и i ii . Металлопротеазы расщепляют преимущественно связи с аминогруппами лейцина или фенилаланина. Они термолабильны, за исключением фермента, выделенного из клеток i i. Из культуральной жидкости i ii 3 выделен и частично очищен препарат, обладающий казеинолитической и эластолитической активностями 4, 8. Среди 0 штаммов бактерий группы i iii, 0 расщепляли казеин на казеиновом агаре 4. Практически все штаммы бацилл данной группы синтезируют фибринолитические ферменты. У изученных штаммов i iii обнаружена способность растворять экспериментально вызванные тромбы. Установлено, что протеазы этих бактерий превращают фибрин в растворимую форму путем расщепления аргининглициновых связей фибрина . Протеазы, выделенные из i iii проявляют активность в отношении белков молока и крови, действуют на эластин, фибрин, коллаген ,, . Из i ii v. Такое воздействие на кровь, возможно, связано с активирующей ролью фермента в отношении протромбина 5. Полученный из i ii ферментный препарат обладал эластазной активностью, не проявляя гемоглобинолитической и фибринолитической активности .