Молекулярные механизмы формирования множественной лекарственной резистентности у Burkholderia pseudomallei и близкородственных видов микроорганизмов

• Автор: Викторов, Дмитрий Викторович
• Шифр специальности: 03.00.07, 03.00.15
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Волгоград
• Количество страниц: 266 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ТАКСОНОМИЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ I I И БЛИЗКОРОДСТВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

1.1 Краткий таксономический очерк рода i

1.2. Особенности генетической организации патогенных i

1.2.1 Структурные элементы геномов буркхольдернй

1.2.2 Сравнительная геномика буркхольдерий группы i

ГЛАВА 2. АНАЛИЗ ОСОБЕННОСТЕЙ ФОРМИРОВАНИЯ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ У I .I И БЛИЗКОРОДСТВЕ1НЫХ ВИДОВ МИКРООРГАНИЗМОВ
2.1 Модельная система для изучения механизмов формирования резистентности буркхольдерий к антибактериальным агентам
2.2 Получение мутантов i i, i i и i ii с фенотипом множественной ангибиотикорезистентности
2.2.1 Характеристика фенотипов резистентности исходных штаммов В. i,
В. i и В ii
2.2.2 Селекция вариантов В. i, В. i и В. ii, устойчивых к цефтазидиму, пефлоксацииу, офлоксацину и имипенему
2.2.3 Анализ перекрестной резистентности мутантов В. i, В. i и В. ii
2.2.4 Вирулентные свойства полирсзистентных мутантов В. i и В. i ГЛАВА 3. ИЗМЕНЕНИЕ ПРОНИЦАЕМОСТИ И ТРАНСПОРТНЫХ СИСТЕМ
КЛЕ ТОЧНЫХ МЕМБРАН ПРИ РАЗВИТИИ МНОЖЕСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ I
3.1 Лекарственная резистентность бактерий, обусловленная изменением экспрессии гюринов
3.2 Белковый состав наружных мембран клеток В. i
и родственных буркхольдерий
3.3 Экспрессия мембранных белков у мутантов В. i, В. i и В. ii с различными фенотипами резистентности
3.4 Получение и характеристика мутантов ii, дефектных по продукции мембранных белков
3.4.1 Инссрционный мутагенез и отбор Вор клонов
3.4.2 Характеристика инссрционных мутантов, дефектных по продукции белков наружных мембран ,
3.5 Проницаемость клеточных мембран и эффлюкс антимикробных соединений у полирезистснтных вариантов i
3.5.1 Устойчивость к неспецифическим ингибиторам
3.5.2 Накопление и выброс бромистого этидия
3.5.3 Резистентность при воздействии блокаторов мембранных каналов
3.6 Изменения экспрессии поверхностных полисахаридов и систем секреции экзо
ферментов
3.6.1 Модификации ЛПС
3.6.2 Продукция экзоиолисахарида
3.6.3 Спектры внеклеточных ферментов
ГЛАВА 4. МНОЖЕСТВЕННАЯ ЛЕКАРСТВЕННАЯ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ I ЭФФЛЮКССИСТЕМЫ
4.1 Резистентность бактерий, обусловленная системами активного выброса антимикробных соединении
4.2 Системы лекарственного эффлюкса патогенных i
4.2.1 Алгоритм сравнительного анализа
4.2.2 Гены лекарственных транспортеров суперсемейства
4.2.3 Г ены лекарственных транспортеров семейства
4.2.4 Г ены лекарственных транспортеров суперемепства
4.3 Дифференциальная экспрессия эффлюксдетерминант при формировании множественной резистентности i
4.3.1 Последовательностимишени и праймеры
4.3.2 Технологические этапы дифференциального дисплея мРНК генов лекарственного эффлюкса
4.3.3 Обратная транскрипция мРНК эффлюкстранспортсров исходных штаммов и полирезистентных лгутантов В. i
4.3.4 Экспрессия эффлюкспоследовательностей у полирезистентных мутантов В.
i, В i и В. ii
4.4 Экспрессия эффлюкспоследовательностей В. i в гетерологичных системах
I 4.4.1 Клонирование последовательностей хромосомы В. i 0 в
ii i и характеристка рекомбинантных клонов
4.4.2 Рестрикционный и гибридизацнонный анализ рекомбинантных плазмид
4.4.3 Анализ продуктов экспрессии рекомбинантных плазмид
4.4.4 Детекция клонированных эффлюкспоследовательностей В i в рекомбинантных штаммах . i
ГЛАВА 5. ИЗМЕНЧИВОСТЬ ДЕТЕРМИНАНТ УСТОЙЧИВОСТИ К ОТДЕЛЬНЫМ ГРУППАМ АНТИМИКРОБНЫХ СОЕДИНЕНИЙ И ГЕНОМНАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ПОЛИРЕЗИСТЕНТНЫХ МУТАНТОВ А
5.1 Мутационные изменения ДНКгиразы А у мутантов i с высоким
уровнем устойчивости к препаратам фторхинолоновой группы
5.1.1 регион В. i, В. i и В. ii
5.1.2 Техника анализа мутаций в последовательностях И
5.1.3. Анализ нуклеотидных замен в ДНКгиразы А мутантных штаммов
I, 5.2 Иитегроноподобные структуры геномов
5.2.1 Детекция ннтегроноподобных последовательностей в штаммах В. i,
В. i и В. ii
5.2.2 Нуклеотидные последовательности интегроноподобных элементов буркхоль
дерий
5.3 Геномная вариабельность полирезистентных вариантов i
5.3.1 Методические аспекты анализа
5.3.2 Генетическая гетерогенность штаммов В. i и родственных видов с
различной чувствительностью к антимикробным соединениям
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


В. ii ассоциирована с высоким уровнем устойчивости к фторхинолоновым и цефалоспориновым антибиотикам. Включение Тп9 и Тп5 в хромосомные локусы детерминант мембранных протеинов , , , , 0 В. Инсерционный мутагенез полирсзистснтного варианта В. Ведущая роль в формировании множественной антибиотикорезистентности В. В. i к антибиотикам различных классов в присутствии соединений блокаторов мембранного транспорта. Сравнительный анализ i ii извеспгых и предполагаемых генов лекарственного эффлюкса В. В. i и В. Участие , и эффлюксдетерминант в формировании антибиотикорсзистенгности множественного типа у видов группы i. Мутационные изменения ДНКгиразы V, наряду со снижением проницаемости оболочки и активацией эффлюкссистем, определяют развитие высокого уровня резистентности к соединениям фторхинолоновой группы у В. В. i. Нуклеотидные замены в у мутантных штаммов приводят к нескольким типам аминокислотных замен в последовательности белка е, и . Геномы штаммов В. В. iii несут участки, структурно сходные с интегронами и представленные генами транспозазинтеграз и кодирующими последовательностями детерминант лекарственной устойчивости эффлюкстранспортсров и семейств. Наличие интегроноподобных структур свидетельствует о потенциальной возможности формирования множественной устойчивости у датптых микроорганизмов за счет аккумуляции и горизонтального переноса детерминант различных типов. Диссертация выполнена на основе государственных плановых тем НИР, в 3 из которых соискатель являлся ответственным исполнителем, и в 3 научным руководителем. Основные результаты исследований изложены в опубликованных работах, в том числе в четырех патентах на изобретение и трех учебных пособиях. Диссертация изложена в форме монографии на 6 листах компьютерного текста, состоит из введения, 5 глав, содержащих необходимые литературные справки, теоретические и экспериментальные разделы и иллюстрации в виде таблиц и рисунков, заключения и выводов. Указатель литературы включает 5 источников. ГЛАВА 1. Микроорганизмы рода i грамотрицательные не образующие спор палочки, подвижные с полярно расположенными флагеллами моно или лофотрихи или неподвижные, лишенные жгутиков В. Микроорганизмы являются факультативными анаэробами, способными использовать нитрат в качестве альтернативного акцептора электронов, продуцируют каталазу, имеют варьирующую оксидазную активность. В условиях аэрации, избыточного содержания углерода и сниженного содержания азота в среде культивирования клетки буркхольдерий обычно образуют включения гранул резервного полимера полироксимасляной кислоты. Клеточные липиды буркхольдерий характеризуются наличием фосфатидилглицсрола. Содержание ГЦпар в ДНК буркхольдерий колеблется в диапазоне . Типовым видом рода является В. Бактерии рода являются обитателями почвы, ризосферы растений, многие виды патогенны для растений и животных ii, . В г. Р. iИ и . II группу рРНКДНК гомологии i . В г. РПК, степени ДНКДНК гомологии, липидных и жирнокислотмых спектров, а также ряда фенотипических признаков выделили данные микроорганизмы в отдельный род i . Род получил свое название в честь американскою бактериолога . Н. , в г. На сегодняшний день, согласно xi i i , 7. Типовым видом рода является i i. Отмстим, что отдельные виды в первую очередь это касается В. Заметное увеличение числа работ по систематике рода i и совершенствованию схем идентификации и дифференциации данных микроорганизмов наблюдается с середины х годов. В основу большинства проведенных исследований были положены принципы полифазной таксономии V . ДНК и рРНК, степени идентичности генов рибосомальных РНК, ДНКфингерпринтов и других V . V . I . I V . V . V . Vi . V . V i v V . Vi . I алЬююЫиса i , . Vii . V , i v v , 6 i iv v v V , i . Vi , , i x v V . V 2СОЗ i v . Vii. V . V V , i i v V , i i v. V i i v v , i i v i , i v Vx V . V сот. V. i , 9Л i i vii v Vii, i xv v V i . Рис. Современная таксономия рода i . Символы и обозначения v описание таксона опубликовано в Ii i vi ii V официально неопубликованные новые таксономические единицы Т типовая единица.