Молекулярно-генетический анализ хламидий : геномика, таксономия, индикация и идентификация

• Автор: Вафин, Рамиль Ришадович
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 290 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Молекулярногенетическая диагностика.

1.1.1. Методы выделения нуклеиновых кислот

1.1.1.1. Детергентный метод

1.1.1.2. Фенольный метод.

1.1.1.3. Фенолыюдетергентный метод

1.1.1.4. Сорбционный метод.

1.1.2. Методы амплификации нуклеиновых кислот.

1.1.2.1. Полимеразная цепная реакция и ее модификации

1.1.2.2. Альтернативные методы амплификации
1.1.3. Геногппирование с учетом полиморфизма единичных нуклеотидов генотипирование.
1.1.4. Проблема контаминации. Методы деконтаминации.
1.2. Таксономия и номенклатура хламидий.
1.2.1. Семейство i
1.2.1.1. Род i.
1.2.1.2. Род i.
1.2.2. Семейство i
1.2.3. Семейство ii.
1.2.4. Семейство i
1.2.5. Семейство ii
1.2.6. Хламидиозы рыб.
1.2.7. Критический взгляд на классификацию хламидий.
1.3. Исторический ракурс изучения проблемы хламидиозов животных
на постсоветском пространстве
1.3.1. Характеристика некоторых штаммов хламидий, выделенных
от млекопитающих.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Штаммы хламидий. Исследованный материал.
2.2. Эпизоотологическое обследование.
2.3. Выделение и идентификация возбудителя хламидиоза
2.4. Серологические реакции
2.5. Люминесцентная микроскопия
2.6. Очистка и концентрирование хламидий.
2.7. Экстракция нуклеиновых кислот исследованного материала
2.8. ПЦР. ПДРФ. Горизонтальный гель электрофорез.
2.9. Секвенирование. Выравнивание и филогенетический анализ.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Совершенствование способов генодиагностики.
3.1.1. Разработка способа выделения ДНК хламидий
3.1.2. Разработка способа проведения ПЦР
3.1.3. Разработка способа защиты ОТГЩР от контаминации продуктами амплификации на основе разрушающего действия урацилДНКгликозилазы.
3.2. Результаты исследования плотоядных животных на хламидиоз
3.2.1. Оценка эпизоотического состояния зверосовхоза Вятский Кировской области РФ в отношении хламидиоза пушных зверей.
3.2.2. Лабораторная диагностика хламидиоза лисиц в зверосовхозе Вятский Кировской области РФ.
3.2.2.1. Вирусологические исследования.
32.2.2. Серологические исследования
З.2.2.З. Молекулярногенетические исследования.
3.2.3. Совершенствование молекулярногенетической индикации
возбудителей хламидиоза
3.2.3.1. Полимеразная цепная реакция ПЦР со специфичными
праймерами для индикации хламидий
3.2.3.2. Выявление возбудителя хламидиоза в патологическом
материале при помощи ПЦР со специфичными праймерами.
3.3. Результаты лабораторных исследований рептилий, амфибий
и декоративных птиц на хламидиоз.
3.4. Молекулярногенетический анализ хламидий
3.4.1. Сравнительная характеристика хламидий по отргену
3.4.2. Сравнительная характеристика хламидий по отр2гену
3.4.3. Сравнительная характеристика хламидий по БрРНК,
5рРНК и наличию экстрахромосомной плазмиды рСр
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВ,УНИЯ
5. ВЫВОДЫ
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Очень важно отметить то, что увеличение флуоресценции может быть связано как с накоплением специфического продукта, так и неспецифического праймерыдимеры, шмер. Для получения корректных результатов необходимо дополнительное изучение полученных ампликонов с помощью построения так называемых кривых плавления i v. Для этого реакционную смесь нагревают и непрерывно измеряют флуоресценцию. По достижении температуры плавления продукта амплификации флуоресценция резко снижается. Каждое резкое уменьшение флуоресценции на графике соответствует числу полосок, получаемых на электрофорезе, . Для облегчения работы с полученной информацией проводят дифференциальный анализ, кривой плавления. Такой способ визуализации полученных данных гораздо удобнее для пониманияи анализа I. . .. . .. 1. Применение кривых плавления не ограничивается только детекцией продуктов амплификаии с помощью бромистого этидия. При использовании кривых плавления в системах с ДНКзондами , возможно различать точечные мутации, расположенные внутри областей связывания ДНКматрицы и зонда. .. . .. , . Использование кривых плавления не требует от оператора амплификатора никаких дополнительных манипуляций с пробирками, а интерпретация полученных данных автоматизирована и формализована. Альтернативные методы амплификации В последнее время для выявления ДНКмишени используются альтернативные методы, при этом не уступающие по чувствительности и специфичности методикам, основанным на методе ПЦР, но существенно более быстрые по времени выполнения. Принципы этих методов несколько отличны от классического варианта ГЩР. Лигазпая цепная реакция ЛЦР i i i. Метод амплификации, предложенный . . . ДНКматрицы. В нем используется способность ДНКлигазы соединять две пары комплементарных олигонуклеотидов после их гибридизации с последовательностями мишени i vi. . Вагапу, . . i . При использовании двух пар, одна из которых комплементарна верхней цепи ДИКматрицы, а вторая нижней, достигается экспоненциальная амплификация. На первом этапе осуществляется гибридизация двух пар олигонуклеотидных зондов с ДНКматрицей при температуре С. Затем происходит лигирование олигонуклеотидов в месте их соединения с образованием более длинного продукта, связанного с матрицей. На втором этапе реакционную смесь нагревают до С. При этом происходит денатурация и отделение лигированного продукта с матрицы. При последующем охлаждении до С процессы гибридизации и лигирования повторяются. Вновь образованные продукты лигирования выступают в качестве матриц в последующих циклах реакции. В ходе ЛЦР происходит экспоненциальное увеличение количества исходных продуктов лигирования . . . . , . . i . Поскольку один из нуклеотидов, участвующих в ЛЦР, ковалентно связан с гаптеном или лигандом, таким, например, как биотин, а другой с репортерной группой, например, такой, как щелочная фосфатаза, выявление продуктов амплификации может происходить непосредственно после амплификации без использования электрофореза или секвенирования ДНК . ii . .. . .. . .. . .. ii, . . . . Тесты системы x10, основанные на лигазной цепной реакции нашли широкое применение в медицине при диагностике возбудителей хламидиозов . ii . .. . .. . .. . .. ii, . . , . Тестирование коммерческих наборов x ЛЦР и i ПЦР в сравнение с культуральными методами показали диагностическую эффективность системы, основанной на лигазной цепной реакции, но определенные трудности, связанные с достижением достоверного порога специфичности ЛЦРтеста не позволили ему конкурировать с методом. ПЦР . . . , . Метод транскрипционной амплификации ii iii .