Молекулярно-генетический анализ штаммов Vibrio cholerae O139

• Автор: Ерошенко, Галина Александровна
• Шифр специальности: 03.00.07, 03.00.15
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 298 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1.1. Бактериальные штаммы

1.2. Питательные среды и реактивы

1.3. Используемые методы.

ГЛАВА 2. АНАЛИЗ ФЕНОТИПИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ШТАММОВ УСНО

1ЕКАЕ , ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ИСТОЧНИКОВ

2.1. Микробиологические и биохимические свойства вибрионов серогрупп и обзор литературы.

2.2. Фенотипический анализ штаммов V. сЪокгае различной вирулентности

2.2.1. Определение продукции капсулы и антигена

2.2.2. Сравнительный анализ питательных потребностей, подвижности, продукции пилей адгезии и устойчивости к антибиотикам
2.2.3. Определение продукции белков внешней мембраны, ферментов
патогенности протсазы, фосфолипазы и гемолизина
ГЛАВА 3. СРАВНЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ШТАММОВ V.
СНОЕЕМЕ , ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ БОЛЬНЫХ И ИЗ ВОДЫ ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОДОЕМОВ.
3.1. Организация генома У.сИокгае и обзор литературы
3.2. Сравнительный анализ генома вирулентных и авирулентных
штаммов V. сИокгае
3.2.1. Изучение структурной организации участков хромосомы вирулентных штаммов серогруппы, содержащих генытоксинообразования сАВ.
3.2.2. Генное зондирование авирулентных штаммов V. скок гае
для выявления в их хромосоме структурных и регуляторных генов вирулентности, а также последовательности ДНК 1 и
генома умеренного фага 9.
3.2.3. Сравнительный ПЦР анализ структуры генома вирулентных
и авирулентных штаммов V. серогруппы .
ГЛАВА 4. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ САР ОБЛАСТИ ХРОМОСОМЫ V.
И РОЛЬ УМЕРЕННОГО ФАГА 9 В ИЗМЕНЕНИИ ВИРУЛЕНТНЫХ И АНТИГЕННЫХ СВОЙСТВ ВОЗ
БУДИТЕЛЯ ХОЛЕРЫ СЕРОГРУППЫ .
4.1. Генетический контроль биосинтеза антигена и полисахаридной капсулы обзор литературы
4.2. Генетическое картирование гена с помощью метода конъюгации.
4.3. Определение сцепленности гена с генами, контролирующими подвижность холерных вибрионов и биосинтез маннозочувствительных гемагглютинируюших пилей адгезии.
4.4. Определение локализации умеренного фага 9.
4.5. Роль фага 9 в фенотипической изменчивости V 9.
4.6. Трансдуцирующие свойства умеренного фага 9
ГЛАВА 5. ИЗМЕНЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА У V. , ВЫЗВАННОЕ ФАГОМ 9
5.1. Умеренные бактериофаги V . и их роль в изменении свойств возбудителя холеры обзор литературы
5.2. Морфология фага 9 и физическая характеристика его ДНК
5.3. Определение присутствия фага 9 в различных штаммах V.
5.4. Изучение распространенности умеренного фага 9 среди штаммов V. и не не серогрупп
5.5. Изменение биосинтеза холерного токсина у V. при интеграции умеренного фага 9 в бактериальную хромосому
5.5.1. Молекулярно биологический анализ штаммов V. , инфицированных фагом 9
5.5.2. Продукция холерного токсина у клеток V. , лизоген
ных по фагу 9.
5.6. Роль фага 9 в изменении свойств, связанных с вирулентностью, у V. классического биопара.
5.6.1. Изучение чувствительности различных штаммов серогруп
пы классического биовара к умеренному фагу 9
5.6.2. Влияние фага 9 на продукцию холерного токсина у штаммов V. классического биовара.
5.6.3. Изучение механизма изменения продукции холерного токсина
у штаммов V. классического биовара, лизогенных по фагу 9
ГЛАВА 6. ОБМЕН ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИЕЙ МЕЖДУ ВИРУЛЕНТНЫМИ И АВИРУЛЕНТНЫМИ ШТАММАМИ У.СНОЬЕЯЛЕ 0.
6.1. Генетический обмен у Уско1егае и его роль в образовании вирулентных штаммов обзор литератры.
6.2. Особенности наследования и экспрессии в клетках авирулентно
го штамма У сИо1егае рекомбинантной плазмиды с генами холерного токсина
6.3. Обмен хромосомными генами между вирулентными и авирулент
ными штаммами У.сИокгае
ГЛАВА 7. МОЛЕКУЛЯРНОЕ ТИПИРОВАНИЕ ШТАММОВ УСНОЬЕЯАЕ С РАЗЛИЧНОЙ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТЬЮ.
7.1. Происхождение У.сИокгае обзор литературы
7.2. Риботипирование штаммов У.сИокгае, полученных от больных и
из объектов внешней среды.
7.3. Генотипирование штаммов У.сИокгае с использованием однопраймерной ПЦР
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ


Отбор трансконъюгантов проводили на селективной минимальной среде, содержащей тетрациклин 2 мкгмл. Контрселекция донора осуществлялась за счет отсутствия в минимальной среде иролииа и гистидина, необходимых для роста . Определение чувствительности культур к холерным фагам. Грациа Лабораторная диагностика холеры, МУ 4. Определение продукции маннозочувствительных гемагглютинирующих пилей адгезии МЧГА. Определение МЧГА проводилось с помощью реакции агглютинации на стекле с 3 человеческими эритроцитами I группы крови но методу , iii . Штаммы культивировали в триптиказосоевом бульоне Дифко США без добавления глюкозы при С в течение часов. Культуру центрифугировали и дважды отмывали в 0,1М фосфатном буфере 7. Клетки суспендировали в 0,1М фосфатном буфере и титровали, получая ряд последовательных двукратных разведений, начиная с 9клмл К 0, мл каждою разведения культуры добавляли по 0, мл 3 взвеси эритроцитов. Ингибирование гемагглютинацми проводили 0,1 раствором машюзы. После тщательного встряхивания плато выдерживали при комнатной температуре С в течение 2 часов. Окончательный учет результатов проводили через часов. Продукция МЧГА коррелировала с гемаглютинирующей способностью микроорганизмов. Определение подвижности. Изолированные колонии бактерий с помощью реплик наносили на поверхность полужидкого 0,6 ЬВ агара и инкубировали при иС в течение часов. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследований. Подвижные штаммы образовывали макроколонии, окруженные ореолом разного размера, тогда как макроколонии неподвижных штаммов были лишены его. Выделение фага 9 и получение фаговой ДНК. Мутная колония штамма У. Иокгае Р4, состоящая из покрытых капсулой клеток, выращивалась в ЬВ бульоне при С в течение часов. Клетки осаждались центрифугированием. Концентрация фага 9 в супернатантной жидкости составляла 8 х БОЕ бляшкообразующих единицмл. Далее культура высокочувствительного штамма У. Иокгае 5 в ранней экспоненциальной фазе роста заражалась полученным фагом с множественностью инфекции равной 1 и инкубировалась до наступления полного лизиса клеток. Титр фага в супернатантной жидкости составлял 5 х 9 БОЕмл. Фаг осаждали в присутствии полиэтиленгликоля и 1М ИаС. Фаговую ДИК экстрагировали по общепринятому методу Т. Маниатис с соавт. Определение чувствительности к фагу 9, его продукции и получение лизогенов. Клетки изучаемого штамма, находящиеся в логарифмической фазе роста, добавляли к 0,7 ЬВ агару и наносили на подложку 1,5 питательного агара ЬВ. На полученный газон помещали каплю фага 9. Результаты учитывали через часа инкубации при С. Выросшие в середине пятен лизиса колонии предполагаемые лизогены отбирали и изучали на способность образовывать инфекционные фаговые частицы клетки выращивали часов в БВ бульоне, супернатант наносили на газон индикаторного штамма 5. Наличие пятен лизиса свидетельствовало о способности отобранных лизогенов продуцировать фаг. Приготовление лизата трансдупирующего фага. Размножение трансдуцирующего холерного фага 9 осуществляли на прототрофных штаммах серогруппы У. Иокгае 5 классического биовара и У. Иокгае СЯС 8 биовара эльтор в 0,4 агаре Мартена по общепринятой методике Миллер Д. Титр фага в полученном лизате составлял 5x9 БОЕмл. Трансдукционные скрещивания. З.ЕХ . Ночную бульонную культуру реципиента разводили в пять раз бульоном ЬВ и выращивали 3 часа с аэрацией при С. Затем культуру реципиента смешивали с фаголизатом в таком соотношении, чтобы множественность инфекции составляла 1,0. Смесь реципиента с фагом помещали на водяную баню при температуре С на минут, затем охлаждали во льду минут и центрифугировали при в течение минут. Осадок разводили в исходном объеме физиологическим раствором и высевали на минимальные селективные среды. Выросшие колонии проверяли по маркерам методом реплик. В надосадочной жидкости определяли содержание фаговых частиц, которое использовали для расчета эффективности трансдукции. Обычно в течение минут при С на клетках холерного вибриона адсорбировалось ,5 фаговых частиц.