Микроорганизмы из переохлажденных высокоминерализованных водных экосистем

• Автор: Печерицына, Светлана Александровна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 133 с. : ил.

1.1 Вечная мерзлота определение, строение, физикохимические условия.

1.2 Криопэги как часть криосферы Земли и модель для астробиологии.

Глава 2. МИКРОБНОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ВЕЧНОМЕРЗЛЫХ ПОРОД.

2.1 Численность бактерий в вечномерзлых грунтах. И

2.2 Разнообразие культивируемых микроорганизмов.

2.2.1 Прокариоты.

2.2.1.1 Характеристика рода

2.2.2 Эукариоты.

2.3 Изучение микробного разнообразия вечномерзлых грунтов методами молекулярной экологии.

2.4 Метаболическая активность i i.

Глава 3. АДАПТАЦИЯ ПРОКАРИОТ К ЖИЗНИ ПРИ НИЗКОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ.

3.1 Физиологические группы бактерий по отношению к температу ре.
3.2 Кинетика роста при низких температу рах.
3.3 Ответ на Холодовой шок как начальный этап адаптации клетки к низкой температуре.
3.3.1 Сенсорные системы клетки.
3.3.1.1 Мембрана.
3.3.1.2 Трансляционный аппарат.
3.3.1.3 ДНК и структурирующие ее белки.
3.3.1 Трехстадийиая модель ответа на Холодовой шок.
3.3.2 Белки холодового шока структура и функция.
3.3.3 Холодовой шок психрофильных и психротрофных бактерий.
3.4 Роль компонентов клетки при адаптации к низкой температуре.
3.4.1 Механизмы адаптации мембраны прокариотической клетки к низкой температуре.
3.4.1.1 Стратегии изменения жирнокислотного состава.
3.4.1.2 Состав полярных групп липидов.
3.4.1.3 Состав белков мембраны.
3.4.1.4 Состав каротиноидов.
3.4.2 Холодоактивные ферменты.
3. Криопротекторы белки и органические осмолиты.
3.5 Геномы психрофильных и психротрофных бактерий.
Заключение по обзору литературы.
Глава 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
4.1 Объекты исследования.
4.2 Районы исследования.
4.3 Гидрохимнческие характеристики криопэгов.
4.4 Микроорганизмы.
4.4.1 Мез оды учета численности бактерий.
4.4.2 Состав сред для ку льтивирования.
4.4.3 Методы контроля чистоты культур.
4.4.4 Микроскопические методы исследования.
4.4.5 Определение параметров роста микроорганизмов.
4.4.6 Изучение культуральных и физиологобиохимических свойств.
4.5 Аналитические методы.
4.5.1 Определение летучих жирных кислот, спиртов и метана.
4.5.2 Определение лактата.
4.5.3 Определение глюкозы.
4.5.4 Определение сероводорода.
4.5.5 Определение белка биомассы.
4.5.6 Определение десульфовиридина.
4.5.7 Определение ионов двухвалентного железа.
4.4. Анализ жирных кислот липидов мембран.
4.6 Анализ внутриклеточного полисахарида Сюйкйит а1допрИИит.
4.6.1 Количественное определение полисахарида.
4.6.2 Получение чистого препарата полисахарида.
4.6.3 Определение способности полисахарида окрашиваться раствором Люголя.
4.6.4 Определение элементного состава полисахарида.
4.6.5 Гидролиз и определение состава мономеров.
4.7 Молекулярногенетические методы исследования.
4.7.1 Выделение и очистка хромосомной ДНК.
4.7.2 Определение нуклеотидной последовательности гена 8 рРНК.
4.7.3 Филогенетический анализ.
4.7.4 Определение ГЦ состава ДНК.
4.7.5 ДНКДНК гибридизация.
4.8 Протеомные методы.
4.8.1 Выделение тотального клеточного белка . iii и его подготовка к двухмерному электрофорезу.
4.8.2 Регидратация стрнпов с иммобилизованным градиентом .
4.8.3 Первое разделение нзоэлектрофокусирование.
4.8.4 Уравновешивание стрипов в тяжелом буфере.
4.8.5 Второе разделение полнакриламиднын гельэлектрофорез.
4.8.6 Окрашивание белков в гелях после электрофореза кумасси бриллиантовым синим 0.
4.8.7 Документирование гелей.
4.8.8 Идентификация белков с помощью массспекгрометрин. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
Глава 5. Численность бактерий в криопэгах различной географической локализации.
5.1 Численность в криопэгах Колымской низменности.
5.2 Численность в криопэгах Варандейского полуострова.
Глава 6. Новые психрофильные и психротолерантные бактерии из арктических криопэгов выделение и характеристика.
6.1 Анаэробные психрофильные спорообразующпе палочки штаммы
6.2 Аэробные штаммы I и 2.
6.3 Сульфатредуцирующая бактерия штамм В.
Глава 7. Адаптация изолятов к отрицательной температуре.
7.1 Особенности роста выделенных бакгерий при отрицательных температурах.
7.1.1 Основные параметры роста выделенных бактерий рода ii
при различных температу рах в периодической культуре.
7.1.2 Образование проду ктов метаболизма анаэробной бактерией С. ii при различных температу рах культивирования.
7. Исследование влияния температуры и солености на скорость роста С. ii и . ii.
7.1.4 Влияние температуры культивирования на спектр утилизируемых
субстратов С. и . ii 2.
7.2 Состав жирных кислот липидов клеточных мембран изолятов при различных условиях культивирования.
7.2.1 Состав жирных кислот липидов мембран С. ii при оптимальной и отрицательной температурах культивирования.
7.2.2 Состав жирных кислот липидов мембран . ii2 при различных температу рах культивирования и соленостях среды повышенной, оптимальной и отрицательной.
7.3 Внутриклеточный полисахарид С. ii.
7.3.1 Состав и свойства внутриклеточного полисахарида С. ii.
7.3.2 Динамика накопления полисахарида в клетках С. ii.
7.4 Протеомный анализ Холодовой адаптации . ii 2.
7.4.1 Исследование дифференциальной экспрессии белков .ii2 методом 2ДПААГ.
7.4.2 Белки . ii2, индуцируемые при отрицательной температуре.
Заключение.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Скрябина . Публикации. По материалам диссертации опубликовано работ. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 3 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 1 ссылок, содержит таблиц и рисунков. Благодарности. Автор искренне благодарен сотрудникам, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы д. Гиличиискому Д. А., к. Ривкиной Е. М за предоставленные пробы криопэгов ИФХиБПП РАН к. Лысенко А. М. за определение уровня ДНКДНК гибридизации и состава ГЦпар в ДНК ИНМИ им С. Н. Виноградского РАН д. Осипову Г. А. за анализ жирнокислотного состава клеток Научный центр сердечнососудистой хирургии им. А.Н. Бакулева к. Сузиной Н. Е. за помощь при выполнении элсктронномикроскопических исследований, к. Гавриш Е. Ю., к. Акимову В. Н. за филогенетический анализ, Лысанской В. И. за анализ мономерного состава полисахарида, а также к. Архиповой О. В., к. Лауринавичюсу К. С., к. Трутко С. М., к. Чувильской и всем сотрудникам лаборатории анаэробного метаболизма микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН. Автор благодарит профессора Марбургского университета М. А. Марахила Германия за руководство при выполнении протеомного анализа. Особую признательность автор выражает к. Щербаковой В. А. за всестороннюю помощь на всех этапах исследований. Глава 1. КРИОБИОСФЕРА КАК СРЕДА ОБИТАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ. Вечной мерзлотой называют грунты, находящиеся по меньшей мере 2 года при температуре 0С и ниже i , р В общей сложности она занимает около поверхности Земли, охватывая широким поясом север Евразии и Северной Америки, покрывает свободные ото льда прибрежные территории Антарктиды, встречается в высокогорной части крупных горных массивов. Вся совокупность вечномерзлых пород называется криосфсрой, или криолитосфсрой. Сезонные изменения температуры воздуха обуславливают оттаивание верхнего слоя вечной мерзлоты летом. Этот слой составляет нескольких десятков сантиметров до м и называется сезоннотатым или активным. Граница между сезонноталым слоем и вечной мерзлотой называется кровлей вечной мерзлоты. Кровля вечной мерзлоты действует как физический и биогеохимический барьер, который ограничивает проникновение поверхностных вод и влияние внешних факторов окружающей среды iii, . Внутри вечномерзлых грунтов существуют различные относительно обособленные структуры рис. Например, талики массив талых пород внутри мерзлой толщи различного генезиса, грунтовый лед все типы льда внутри вечной мерзлоты, а также криопэги высокоминерализованные подземные воды с постоянной отрицательной температурой. Рис 1. Схематическое изображение вечной мерзлоты и се компонентов v . Температура в вечномерзлых почвах Арктики варьирует от 0 до С, в то время как в Антарктике от до С. Содержание органического вещества колеблется от 0. В, соленость не превышает . В целом исследованные пробы вечномерзлых грунтов Антарктики содержат намного меньше органического вещества, имеют более щелочной и более высокий окислителыювосстановителыгый потенциал. Концентрация кислорода и азота в породах были такими же, как и в атмосфере, в то время как концентрация метана и углекислого газа значительно выше табл. Таблица 1. Физикохимические свойства вечномерзлых грунтов. Мерзлота Арктики, Колымская низменность, Сибирь От современного до 5 млн. Vv . Viiv . Вечномерзлые грунты Арктики, Канада 0 От современного до тыс лет . Вечномерзлые грунты Антарктики 0 0 тыс. Vv . Даже при отрицательных температурах в вечномерзлых грунтах присутствует вода в жидкой фазе. Она существует в виде тонких пленок, окружающих частицы грунта или льда. Толщина пленок составляет от нм при 1. С до 5 нм при С Шукта е1 а1. Считается, что наличие пленок незамерзшей воды является очень важным для бактерий. Было высказано предположение, что они защищают живые клетки от повреждения кристаллами льда и служат в качестве питательной среды. Кроме того, пленки обеспечивают необходимый для поддержания жизнедеятельности массоперенос ОШсЫгеку, .