Механизмы и роль освобождения поверхностного белка ActA во взаимодействии Listeria monocytogenes с эпителиальными клетками

• Автор: Сапенко, Татьяна Петровна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 92 с. : 10 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Глава 1. ВВЕДЕНИЕ

Глава 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1.Общие сведения о ii

2.2. Особенности биологии и экологии листерий и их значение в распространении листериоза.

2.2.1. Общая характеристика и таксономия листерий

2.2.2. Биология возбудителя

2.3. Механизмы взаимодействия листерий с эукариотической клеткой.

2.4. Механизмы активной инвазии в непрофессиональные фагоциты.

2.5. Функции белка во взаимодействии . с эпителиальными клетками.

Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Использованные штаммы, плазмиды и клеточные линии
3.2. Микробиологические методы
3.2.1. Условия культивирования.
3.2.2. Приготовление и трансформация компетентных клеток .i плазмидной ДНК .
3.2.3. Приготовление и трансформация компетентных клеток . плазмидной ДНК.
3.3. Молскулярно генетические методы.
3.3.1. Выделение хромосомной ДНК
3.3.2. Приготовление грубых лизатов ii . для проведения ПЦР.
3.3.3. Приготовление лизатов из колоний
3.3.4. Выделение плазмидной ДНК для .i.
3.3.5. Выделение плазмидной ДНК для .
3.3.6. Полимеразная ценная реакция.
3.3.7. Осаждение продукта ПЦР для последующего анализа.
3.3.8. Рестрикционный анализ, дефософолирнрование, лигирование ДНК.
3.3.9. Электрофорез в агарозном геле.
3.3 Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля
3.4. Биохимические методы
3.4.1. Разделение освобожднных белков и белков клеточной стенки . методом электрофореза в системе Лэммли.
3.4.2. Приготовление бактериального иннокулята для заражения эукариотических клеток.
3.4.3. Определение эффективности процесса внутриклеточною вхождения листерий инвазии, внутриклеточного размножения и межклеточного перемещения
3.4.4. Обработка эукариотических клеток гепариназой
3.4.5. Обработка бактерий гепарином
Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. Изолирование мутантного штамма с нарушенным процессом освобождения белка .
4.2. Присутствие белка во фракциях мембранных и освобожднных белков .
4.3. Изменение подвижности освобожднной формы белка по сравнению с мсмбраносвязанной формой
4.4. Определение сайта прогеолитического расщепления белка при его переходе из мембраносвязанной в освобожднную форму
4.5. Анализ мутации, нарушающей сайт протеолнза белка .
4.6. Анализ роли металлопротсазы Мр1 в процессе освобождения белка
4.7. Изучение роли освобожднной формы белка АЩА в процессе внутриклеточного проникновения, размножения и межклеточного перемещения Ь топосуюепея в
эпителиальных клетках.
4.8. Роль освобожднной формы белка во взаимодействии с гепарансульфат протеогликанами
4.9. Роль белка системы врожднного иммунитета в защите макроорганизма от инвазии . , опосредованной белком .
Глава 5. ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 6. ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Интенсивные исследования в области биологии и генетики патогенных бактерий позволили достигнуть к настоящему времени значительного прогресса в области изучения взаимоотношений внутриклеточных бактериальных паразитов и эукариотических клеток. Был установлен целый ряд механизмов, позволяющих бактериям проникать и успешно размножаться внутри клеток, а также распространяться по тканям и органам млекопитающих, приводя к развитию тяжелых заболеваний. Эффективность функционирования этих механизмов обеспечивается продукцией бактериями факторов патогенности белковой природы, которые прямо взаимодействуют со специфическими рецепторами эукариотических клеток, влияя на сигнальные системы и внутриклеточные процессы Белый Ю. Ф., Бондаренко В. М., , Ермолаева С. Л. и др. Изучение молекулярных механизмов активности факторов патогенности имеет как фундаментальную, так и практическую значимость, т. Типичным представителем группы факультативных внутриклеточных паразитов и удобной моделью для изучения внутриклеточного паразитизма является грамположительная бактерия ii , возбудитель тяжелого заболевания человека и домашних животных листериоза Тартаковский И. С. и др. V . Листерии попадают в эпителиальную клетку в результате активной инвазии или захватываются макрофагами, разрушают фагосому и выходят в цитоплазму, где эффективно размножаются. Внутриклеточное перемещение листерии осуществляется благодаря полярной полимеризации эукариотического актина на одном полюсе бактериальной клетки. Листерии обладают значительным набором факторов патогенности, осуществляющих сложные взаимодействия с эукариотическими клетками. Установление структуры и механизмов активности факторов патогенности необходимо для разработки диагностических и терапевтических средств контроля заболевания вызываемого лисгериями листериоза. Одним из важнейших факторов патогенности листерий является белок , который, повидимому, можно отнести к числу бифункциональных факторов патогенности. Установлено, что белок , обладающий функцией полимеризации эукариотического актина, является необходимым и достаточным фактором для осуществления внутриклеточного перемещения бактерии , i, . Недавние результаты продемонстрировали, что белок так же может быть вовлечен в индукцию фагоцитоза при взаимодействии листерий с эпителиальными клетками . Однако до настоящего момента молекулярные механизмы, лежащие в основе бифункциональности белка , не установлены. С бактериальной мембраной белок связан через карбоксильный трансмембранный домен, а механизм его освобождения до настоящего времени оставался неизвестным. Показано, что поверхностносвязанный белок необходим для осуществления внутри и межклеточного перемещения возбудителя , i, . Роль же освобожденной формы белка в вирулентности листерий до настоящего времени не изучалась. Цель работы установить механизмы освобождения поверхностного белка и роль его освобожденной формы в процессе проникновения, внутриклеточного размножения и межклеточного перемещения . Ас1Л с поверхностными рецепторами эукариотических клеток и роль этого взаимодействия в процессе внутриклеточного проникновения, размножения и межклеточного перемещения Ь. Впервые установлено, что освобождение белка Ас1А связано с протеолизом мембранного домена, который происходит между гистидином в положении 2 и треонином в положении 3. Впервые произведена сайтспецифичсская замена гистидина в положении 2 в последовательности Ас1А на пролин и продемонстрировано, что данная замена нарушает освобождение белка. Установлено, что процесс протеолитического расщепления трансмембранного домена белка не зависит от среды и отличается от протеолиза этого белка, осуществляемого металлопротеазой Мр1. Впервые показано участие освобожденной формы белка АсА в процессе инвазии листерий в эпителиальные клетки, а также продемонстрировано, что для процесса внутриклеточного перемещения данная форма белка АсхА не является необходимой. Подтверждена гипотеза о белке Ас1А как бифункциональном факторе патогенности и продемонстрировано, что изменение функции белка может быть следствием изменения его локализации.