Метаболизм азота и водорода у гетероцистных цианобактерий

• Автор: Трошина, Ольга Юрьевна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 101 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Общая характеристика цианобактерий

Глава 2. Ферменты, участвующие в метаболизме азота у цианобактерий

2.1. Нитрогеназы и их распространение среди цианобактерий

2.1.1. Состав, структура нитрогеназы и тгены

2.1.2. Источники АТФ и восстановителя

2.1.3. Регуляция синтеза и активности

2.2. Ферменты, участвующие в ассимиляции аммония, и их регуляция

2.3. Метаболизм аргинина у цианобактерий

Глава 3. Свойства и функции гидрогеназ цианобактерий
3.1. Нгпоглощающая гидрогеназа и ее распространение у цианобактерий
3.1.1. Биохимические свойства
3.1.2. Физиологические функции
3.1.3. Регуляция синтеза
3.1.4. Взаимосвязь Нгпоглощающей гидрогеназы и нитрогеназы
3.2. Обратимая гидрогеназа
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 4. Объекты и методы исследования
4.1. Объекты исследования и условия культивирования
4.2. Определение активности ферментов
4.2.1. Активность нитрогеназы
4.2.2. Активность обратимой гидрогеназы
4.2.3. Активность Нгпоглощающей гидрогеназы
4.2.4. Активность глутаминсинтетазы
4.2.5. Активность аргининосукцинатлиазы
4.2.6. Активность уреазы
4.3. Электрофорез
4.4. Другие определения
4.5. Молекулярные методы
4.5.1. Выделение ДНК и электрофорез
4.5.2. Гидролиз ДНК рестрикционными эндонуклеазами,
дефосфорилирование и лигирование в вектор
4.5.3. Создание праймеров, полимеразная цепная реакция и мечение зондов
4.5.4. Ссквенирование ДНК
4.5.5. Саузерн гибридизация
4.5.6. Удаление ДНКзондов с мембран
4.5.7. Получение компетентных клеток Е. i
4.5.8. Трансформация компетентных клеток
4.5.9. Скрининг космидной библиотеки . РСС 2
4.6. Гетерологичная экспрессия . РСС 2 и
очистка рекомбинантной аргининосукцинатлиазы
4.7. Определение концсвой аминокислотной последовательности
4.8. Точность и воспроизводимость измерений РЕЗУЛЬТАТЫ
Глава 5. Регуляция азотфиксацин гетероцистных цианобактерий
5.1. Рост и активность ферментов азотного метаболизма у
дерепрессированных по нитрогеназе мутантов цианобактерии .
5.2. Фотообразование аммония мутантами .
5.3. Влияние соотношения на синтез нитрогеназы у . viii
5.4. Влияние аммония на активность нитрогеназы . viii Глава 6. Метаболизм водорода у гетероцистных цианобактерий
6.1. Взаимосвязи синтеза нитрогеназы и водородпоглощающей гидрогеназы у . viii. Влияние водорода и органическою субстрата
6.2. Распространение обратимой гидрогеназы у разных штаммов . . и .
Глава 7. Биосинтез аргинина у . РСС 2 Аргининосукцинатлиаза
7.1. Демонстрация активности аргининосукцинатлиазы у . РСС 2
7.2. Клонирование и функциональная экспрессия . РСС 2
в ii i
7.3. Организация генов у . РСС2
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Многие цианобактерии синтезируют уникальное запасное азотсодержащее вещество цианофицин, представляющий собой полимер аргинина и аспартата. Недавно показано, что мутантауксотроф цианобактерии i по аргинину не образует цианофицин, не проявляет дифференцировку гетероцист и, соответственно, азотфиксацию . Это подтверждает важную роль аргинина в азотном метаболизме цианобактерий. Однако его биосинтез у цианобактерий практически не исследовался. Практическому использованию цианобактерий как продуцентов аммиака и Н2 препятствует слабая изученность ферментных систем метаболизма азота и водорода и их регуляции у этих микроорганизмов. Исходя из вышеизложенного и были сформулированы следующие цели и задачи данной работы. Цель и задачи исследовании. Целью данной работы было исследование регуляции синтеза основных ферментов азотного и водородного метаболизма гетероцистных цианобактерий, а именно 1 нитрогеназы, катализирующей начальный этап ассимиляции молекулярного азота, 2 аргининосукцинатлиазы, катализирующей конечный этап образования аргинина, и 3 водородпоглощающей гидрогеназы, рециклизирующей молекулярный водород, выделяемый нитрогеназой рис. Рис. Этапы ассимиляции азота и метаболизма Н2, исследуемые в данной работе выделены красным и синим цветом. Выяснить факторы, влияющие на скорость фотообразования аммония у дикого штамма и у его мутантов с дерепрессированным синтезом нитрогеназы. Изучить взаимосвязь между синтезом нитрогеназы и внутриклеточным соотношением , а также особенности регуляции активности нитрогеназы ионами аммония у цианобактерии viii. Провести сравнительное исследование индукции синтеза нитрогеназы и Н2поглощающей гидрогеназы у . Изучить распространение обратимой гидрогеназы у разных штаммов цианобактерий . . Показать наличие аргининосукцинатлиазы АСЛ в клетках цианобактерии . РСС 2, исследовать регуляцию синтеза АСЛ, клонировать и охарактеризовать , кодирующий АСЛ . РСС 2. Новизна работы. Установлено, что мутанты . Впервые показано, что у фотоавтотрофно растущих культур . приводит к индукции синтеза нитрогеназы. Выяснено, что ингибирование нитрогеназной активности аммонием у цианобактерий обусловлено снижением транспорта органических соединений в гетероцисты вследствие ассимиляции аммония. Установлено, что синтез нитрогеназы и ЬЬпоглощающей гидрогеназы у . Наличие обратимой гидрогеназы не является обязательным для гетероцистных цианобактерий. Показано наличие активной аргининосукцинатлиазы в клетках . РСС 2 и установлено, что ее синтез не репрессируется аргинином. Впервые клонирован и охарактеризован цианобактериальный , кодирующий аргининосукцинатлиазу, и получена его функциональная экспрессия в клетках ii i. Научная н практическая значимость работы. Полученные в работе данные расширяют имеющиеся представления о метаболизме азота и водорода у гетероцистных цианобактерий и могут служить научной основой для создания разнообразных штаммовпродуцентов, в частности Н2 и 3. 3 мутантами . Апробация работы. Материалы диссертации доложены на VII Международном симпозиуме по фотосинтезирующим прокариотам США, , , на VIII симпозиуме стран восточной Европы по биологической азотфиксации Саратов, , на всесоюзной конференции Микроорганизмы в сельском хозяйстве Пущино, , на X международном конгрессе по азотфиксации СанктПетербург, , на V международной конференции по молекулярной биологии гидрогеназ Франция, vi, , на международной конференции по биологическому образованию Нг США, ii, , на XI конференции северных стран по азотфиксации Швеция, Стокгольм, . Публикации. По материалам диссертации представлено в печати 8 публикаций. Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов, изложения экспериментальных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Текст диссертации занимает 0 страниц, содержит рисунка и 8 таблиц.