Материалы к характеристике лектинсвязывающего адгезина в поверхностных структурах лактобактерий

• Автор: Анохина, Ирина Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 93 с. : 9 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Нормальная микрофлора. Пробиотические препараты

Механизм действия пробиотиков две концепции.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Материалы

2.1.1 Коллекция микроорганизмов

2.1.2 Характеристики лактобактерий.

2.1.3 Питательные среды

2.1.4 Тестсистемы.

2.1.5 Сыворотки
2.1.6 Буферные растворы и реагенты.
2.1.7 Биологический материал.
2.1.8 Оборудование.
2.2. Методы
2.2.1. Изучение морфологических и культуральных свойств
2.2.2 Изучение биохимических свойств.
2.2.3 Получение иммунных сывороток.
2.2.4 Реакция агглютинации РА
2.2.5 Отбор агглютинирующих и не агглютинирующих колоний в популяции . 4 проводили в РА на стекле
2.2.6 Изучение адгезивных свойств лактобактерий
2.2.6.1 Адгезия лактобактерий на ЭВ.
2.2.6.2 Адгезия лактобактерий на эритроцитах реакция гемагглютинации
2.2.7 Изучение антагонистических свойств культуральной жидкости ЮК лактобактерий по отношению к ДПГ .i и .i.
2.2.7.1. Реакция торможения адгезии ДПГ рода i и .i штаммы
К, М и на клеткахмишенях под действием КЖ
лакгобактерий.
2.2. Торможения реакции гемагглютинации РГА.
2.2.8 Выделение лекгинсвязывающего компонента ЛСК из I лакгобактерий с помощью метода мембранной диафильтрации
2.2.9 Определение количества белка, выделенного из ЮК лакгобактерий .
2.2. Выделение ЛСК из концентрата КЖ с помощью аффинной хроматографии Ьа1сЬметод
2.2. Отмена иммунофлюорисценции с использованием кон А.
2.2. Сорбция сыворотки к . 4 культурой . 4 клон 3.
2.2. Статистическая обработка полученных данных
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.
3.1. Сравнительный анализ производственных и коллекционных штаммов лактобактерий.
3.1.1 Выявление штамма, экспрессирующего наибольшее количество ЛСК в среду культивирования.
3.1.1.1 Морфологические, культуральные и биохимические свойства лактобактерий.
Изучение морфологических свойств
Изучение культуральных свойств
Изучение биохимических свойств
3.1.1.2 Агглютинационная активность культур по отношению к коиА.
3.1.1.3 Агглютинационная активность культур по отношению к иммуноспецифической сыворотке . 4
3.1.1.4 Агглютинационная активность клонов .
3.1.2 Характеристика изучаемых культур по их адгезивной активности
3.1.2.1 Адгезия лактобактерий на поверхности эритроцитов барана, морской свинки, человека IV и ii крови и химически чистых биосубс гратах.
3.1.2.2 Адгезия лактобактерий на поверхности эпителиальных клеток
3.1.3 Выявление ЛСК в ЮК лактобактсрий. Модулирующая активность КЖ в отношение ДПГ .i и .i при адгезии на клеткахмишенях ЭВ
3.1.3.1 Реакция кольцепреципитации КЖ с конА и определение концентрации белка в исследуемых КЖ лактобацилл.
3.1.3.2 Торможение адгезии ДПГ .i Л9 и iпозитивного штамма .i 7 на поверхности ЭВ с помощью КЖ разных штаммов лактобактерий.
3.1.3.3 Тестирование ЛСК с помощью иммунохимического метода непрямой метод Кунса
3.1.3.4 Сорбция сыворотки лактобактериями обработанными и не обработанными конА
3.2. Изучение свойств компонентов КЖ штамма . 4 клон 3 и их способность оказывать модулирующее действие на адгезию ДПГ
.i к ЭВ.
3.2.1. Антагонистическая активность культуры . штамма 4.
3.2.2. Бактерицидная активность культуры . штамма 4 клон 3.
3.2.3 Модулирующее действие КЖ штамма . 4 клон 3 на адгезию ДПГ i i к ЭВ
3.3. Изучение свойств ЛСК КЖ . штамм 4 клон 3 и . 8 3 как перспективного составляющего композитного пробиотического препарата.
3.3.1 Выделение и частичная очистка искомого продукта.
3.3.2 Изучение свойства лсктинсвязывающего комплекса
3.3.3 Определение модулирующей активности ЛСК на адгезию тесткуль гур ДПГ С.а1Ысапв и Е.соН к ЭВ клинически здоровых женщин.
ОБСУЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
ОСНОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
ДПГ дрожжеподобные грибы
ЗФР забуференный физиологический раствор
кон А конканавалин А
КЖ культуральная жидкость
мясораститсльная среда
РА реакция агглютинации
РГА реакция гемагглютинации
ЭВ эпителиоциты влагалища
ФР физиологический раствор
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Изучение свойств ЛСК КЖ . Выделение и частичная очистка искомого продукта. Определение модулирующей активности ЛСК на адгезию тесткуль гур ДПГ С. Ысапв и Е. Н к ЭВ клинически здоровых женщин. ОБСУЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. В настоящее время широкое распространение дисбиотических состояний среди населения всех возрастов требует активного развитая индустрии препаратов и продуктов с пробиотическими свойствами. По современным представлениям дисбактериоз это не локальное заболевание, а основа, на которой строятся многие независимые друг от друга болезни. На сегодняшний день большое внимание уделяется дисбактериозам желудочнокишечного и урогенитального трактов человека. По данным литературы, дисбактериоз в РФ определяется у населения. Для создания колонизационной резистентности организмахозяина по отношению к болезнетворным микробам, а также, для поддержания метаболических процессов, протекающих в макроорганизме, важное значение имеет нормальная микрофлора различных биологических ниш организма человека. В свою очередь слизистая оболочка это также уникальное образование, в котором различные микроорганизмы способны оказывать то или иное действие. Контакт между микроорганизмом и слизистым слоем человека влиянием обоих сторон играет важную роль в поддержании здоровья человека, поскольку стимулирует ответ иммунной системы на инфекцию и за счт бактериального антагонизма ингибирует колонизацию терминальных ниш патогенными бактериями. Лактобациллы одна из групп бакгерий, которая естественна для терминальных ниш организма человека. Пробиотики на основе лактобактерий интенсивно изучаются в экспериментальных исследованиях и клинической практике. Существует два варианта, объясняющих механизм их благоприятного действия на макроорганизм. Второй вариант допускает интенсивное размножение пробиотических культур в просвете терминальной ниши, которая в этом случае рассматривается как биологический ферментер. Накапливающиеся при этом в среде культивирования бактериодины, метал протеи назы, слущивающиеся с поверхности лактобактерии специфические адгезины блокируют и дезинтегрируют условнопатогенную и патогенную микрофлору, защищая т. Признавая право на существование обоих современных концепций, описывающих механизм действия пробиотиков на основе лактобактерий, можно предположить, что наилучшую композицию пробиотического препарата может дать комбинация штаммовпродуцентов, в которой будут присутствовать как микроорганизмы, несущие на своей поверхности слущивающийся с поверхности лактобактсрии специфические адгезины, так и культуры, адгезивную активность которых определяют лектиноподобные структуры, плотно связанные с бактериальной стенкой. Выделение слу щи вающихся поверхностных адгезинов позволит микрокапсулировать эти структуры и создать условия, в которых пробиотический препарат при отсутствие биотопозависимости будет способен экранировать сайты связывания i клеткахмишенях от представителей болезнетворной флоры. Нель и задачи исследовании. Сравненительное изучение производственных штаммов лактобактерий на предмет оценки их морфологических, биохимических и физиологических свойств. Отбор штаммов лактобактерий, различающихся по признаку агглютинации с конканавалином А конА. Проведение селекции полученных клонов лактобактерий с высокой агглютинационной активностью в отношении конА. Выделение поверхностного лектинсвязывающего компонента ЛСК лактобактерий и оценка его роли в феномене адгезии к эукариотическим клеткаммишеням. Впервые коллекция различных видов лактобакгерий, используемых в производстве пробиотических препаратов, а также эталонные штаммы лактобацилл были протестированы в реакции агглютинации с конА и охарактеризованы по их адгезивной активности. Впервые установлено, что экспрессия рыхлосвязанных с клеточной стенкой адгезинов характерна не для всех пробиотических культур и варьирует в пределах одного вида лактобактерий. Впервые удалось выделить варианты лактобацилл с выраженной экспрессией лекинзависимых структур и варианты, не экспрессирующие их.