Конструирование штамма Esherichia coli, экспрессирующего ген zonula occludens toxin Vibrio cholerae

• Автор: Писанов, Руслан Вячеславович
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Ростов-на-Дону
• Количество страниц: 151 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений используемых в работе

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. СТХЭЛЕМЕНТ И ДРУГИЕ ФАКТОРЫ

ВИРУЛЕНТНОСТИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ

1.1. Структурная организация СТХэлемента.

1.2. Особенности размножения, горизонтальной передачи

и интеграции СТХр в хромосому хозяина.

1.3. Неполный СТХэлемент рге СТХф.

1.4 Характеристика xi.

1.4.1. Физикохимические свойства и его биологическая активность
1.4.2. Зонулин
1.4.3. Рецептор и механизм действия зонулина
1.5. xi
1.6. Другие дополнительные токсины холерных вибрионов
1.6.1. Цитотоксический комплекс X.
1.6.2. Новый холерный токсин
1.6.3. Токсин .
1.6.4. Токсин .
1.6.5. Токсин .
1.6.6. Термостабильный токсин.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Штаммы и плазмиды
2.2. Материалы и реактивы.
2.3. Культивирование микроорганизмов
3
2.4. Изучение биохимических свойств.
2.5. Молекулярногенетические методы
4 2.5.1.Выделение ДНК.
2.5.2. Электорофоретические методы
исследования ДНК.
2.5.3. Молекулярное зондирование
2.5.4. Полимеразная цепная реакция
2.5.5. Клонирование генов.
2.6. Методы выделения и характеристики белков.
2.6.1. Выделение и очистка рекомбинантного белка
2.6.2. Электрофоретическое исследование белка.
2.7. Методы изучения биологического действия
и активности токсинов
2.7.1. Исследования i viv.
2.7.2. Исследования i vi
2.8. Постановка реакции преципитации
2.9. Методы компьютерного анализа.
ГЛАВА 3. КОМПЬЮТЕРНЫЙ АНАЛИЗ
XI И XI
3.1. Компьютерный анализ гена и кодируемого им
3.2. Компьютерный анализ гена асе и кодируемого им
белка.
ГЛАВА 4. КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА
Vii В ii i.
4.1. Клонирование гена
4.2. Субклонирование фрагмента ДНК холерного вибриона, содержащего гены и асе
4.3. Анализ рекомбинантных клонов.
4.4. Изучение биологического действия рекомбинантного белка на культуру СаСо2.
4.5. Характеристика рекомбинантного белка
4.5.1. Выделение препарата .
4.5.2. Изучение биологического действия препарата i vi.
ГЛАВА 5. ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ И ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ, СОДЕРЖАЩИХ ПРОКСИМАЛЬНУЮ ЧАСТЬ СТХЭЛЕМЕНТА
5.1. Биохимические свойства
5.2. Изучение вирулентности на лабораторных моделях
5.2.1. Изучение вирулентности i viv
5.2.2. Изучение вирулентности i vi.
5.3. Выявление способности к синтезу .
5.4. Генотипическая характеристика.
5.4.1. Изучение геномного полиморфизма.
5.4.2. Выявление генетических детерминант дополнительных факторов вирулентности с помощью ПЦР
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ


Научнопрактическая ценность работы. На основе штаммов кишечной палочки созданы продуценты рекомбинантных плазмид, экспрессирующих ген под контролем собственного промотора и 1 аспромотора, а также рекомбинантный штамм . Штаммы депонированы в коллекции Российского противочумного института Микроб под номерами КМ 1, КМ 2 и КМ 3. Сконструированы новые праймеры и молекулярные зонды для проведения скрининга свежевыделенных культур на присутствие генов и асе. Полученные данные включены в методические рекомендации Определение генов и асе у Vii с помощью полимеразной цепной реакции, одобренные Ученым советом Ростовского НИПЧИ и утвержденные директором апреля года протокол 5. Показана возможность использования культур клеток СаСо2, и 9 для выявления биологической активности препаратов i vi, а также летальное действие Асе на культуру СаСо2. С помощью компьютерного анализа генов и асе и кодируемых ими продуктов получены новые данные о свойствах и функциях этих белков. Расширены представленияУвозможных о механизмах их участия в фаговом морфогенезе и реализации биологического действия на клетки макроорганизма. Клонирование ПЦРамплификатов гена в . Содержащие их штаммы кишечной палочки экспрессирровали клонированный ген под контролем собственного промотора и промотора. Штамм, содержащий и асе, одновременно экспрессировал оба клонированных гена. Препарат , выделенный из рекомбинантного штамма . СаСо2, и 9, которые представляли адекватную модель для тестирования токсина. Генотипическая и фенотипическая характеристика штаммов холерных вибрионов, содержащих неполный СТХэлемент, свидетельствует о том, что, несмотря на отсутствие генов холерного токсина, эти штаммы обладают вирулентностью за счет экспрессии других факторов. С помощью блотгибридизации выявлено по меньшей мере 6 этиологически опасных клонов. Апробация работы. Результаты исследования были доложены на научных конференциях молодых ученых РостовскогонаДону научноисследовательского противочумного института в гг. Холера и патогенные для человека вибрионы межведомственного научного совета по санитарноэпидемической охране территории РФ в г. VIII Российской научнопрактической конференции по проблеме Холера, РостовнаДону, . План диссертационной работы одобрен Ученым советом РНИПЧИ и утвержден директором протокол 6. Х и асе кассеты вирулентности холерных вибрионов, номер госрегистрации 34. Публикация результатов исследований. Материалы исследования отражены в 7 опубликованных работах. Структура работы. Диссертация изложена на 1 странице и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3х глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего работ отечественных и 3 зарубежных авторов. Работа содержит 8 таблиц и иллюстрирована рисунками. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1. Как достоверно установлено на сегодняшний день, генетические детерминанты холерного токсина СТ, или холерогена, основного фактора вирулентности холерных вибрионов гены x являются составной частью так называемой кассеты вирулентности, которая была впервые описана i М. Позднее оказалось, что кассета вирулентности в свою очередь представляет собой коровую область умеренного филаментозного фага СТХф, или СТХэлемента М. К., . ., . Геном СТХф содержит одноцепочечную ДНК размером 6,9 т. РФ плазмиду рСТХ. В дальнейшем была установлена не только структурная организация этого фага, но и его локализация на хромосоме холерных вибрионов и связь с другими генами рис. Известно также, что у холерных вибрионов классического биовара копии профага имеются в обеих хромосомах, тогда как у вибрионов эльтор и Бенгал они обнаруживаются только в составе большой хромосомы и часто образуют тандемные повторы из двух и более копий i М. . М. . . ., Смирнова Н. И., Смирнова Н. И. с соавт. 2 размером 2,4 т.