Каталаза и супероксиддисмутаза у метаногенных архей

• Автор: Брюханов, Андрей Леонидович
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 185 с. : ил

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Отношение строгих анаэробов к кислороду

1.2. Токсическое действие молекулярного кислорода

1.3. Каталаза у облигатных анаэробов

1.3.1. Распространение каталазы у строгих анаэробов

1.3.2 Влияние гемина на активность каталазы у строгих анаэробов

1.4. Супероксиддясмутаза СОД у облигатных анаэробов

1.4.1. Распространение СОД у облигатных анаэробов

1.4.2. Типы СОД

1.4.3. Другие белки, обладающие СОД активностью

1.5. Облигатные анаэробы и окислительный стресс

1.5.1. Физиологический ответ на окислительный стресс индукция СОД и каталазы
1.5.2. Ответ на окислительный стресс на уровне транскрипции
1.6. Заключение
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Микроорганизмы, использованные в работе
2.2. Культивирование строго анаэробных микроорганизмов
2.2.1. Среды для культивирования строго анаэробных микроорганизмов
2.2.2. Техника анаэробного культивирования по Хангейту
2.3. Определение биомассы
2 4 Получение экстрактов клеток
2.5. Получение клеточных фракций
2.6. Очистка каталазы и СОД
2 6.1. Осаждение сульфатом аммония
2 6.2. Колоночная хроматография в системе
2.7. Концентрирование ультрафильтрация препаратов
2.8. Электрофорез белков в полиакриламидном геле
2 8.1. электрофорез
2 8.2. электрофорез нативных белков
2.9. Окрашивание белковых гелей с помощью раствора Кумасси
2 Мембранный Вестернблоттинг
2 Определение молекулярной массы белков
. Гельфильтрация
. Массспектрометрия
2. Определение активности каталазы
2 Определение активности пероксидазы
2 Определение активности СОД
2 Определение белка по методу Брэдфорда
2 Определение спектра очищенного белкового препарата
2 Атомная абсорбционная спектроскопия
2 Определение концевой последовательности аминокислот
2 Выделение хромосомной ДНК из клеток микроорганизмов
2 Выделение РНК из клеток микроорганизмов
2 Количественное определение нуклеиновых кислот
2 Полимеразная цепная реакция ПЦР
2. Клонирование ПЦР продукта в векторе
. Лигирование в вектор
2. 2 Трансформация с использованием клеток ТОРЮ
. Анализ трансформантов
. Выделение и очистка многокопийной плазмидной ДНК
2 . Расщепление ДНК рестриктазами
2 Мечение олигонуклеотидов дигоксигениндУТФ
2 ДНКДНК гибридизация по Саузерну
. Предгибридизация
2. 2. Гибридизация
. Детекция
2 Клонирование генов
. Создание экспресс библиотеки ДНК
2. 2 Инфицирование Е. i X1 фагом А
. Гибридизация фаговых бляшек
. Детекция
. Рескрининг
. Клонирование
2 Секвенирование
2.1. Отжиг
2. 2. Приготовление геля для секвенса
2.3. Секвенирование
2 Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле
2 Электрофорез ДНК в полиакриламидном геле
2 Статистическая обработка результатов
2. Хранение культур микроорганизмов и препаратов
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Поиск каталазной активности в клетках строго анаэробных
микроорганизмов
3.2. Поиск СОД активности в клетках строго анаэробных
микроорганизмов
3.3. Очистка и изучение свойств каталазы из vi
ii
3.3.1. Влияние гемина на активность каталазы
3.3.2. Очистка каталазы из М. ii
3.3.3. Молекулярные свойства каталазы М ii
3.3.4. Каталитические свойства каталазы М. ii
3.3.5. Ген. кодирующий каталазу М ii
3.4 Очистка и изучение свойств СОД из i i
3.4.1. Очистка СОД из М. i
3.4.2. Молекулярные свойства СОД из М. i
3.4.3. Изучение содержания металла в активном центре СОД
3.4.4. Действие ингибиторов на активность СОД из М. i
3.4 5. Аминокислотная последовательность СОД
3 4.6. Нуклеотидная последовательность гена и фланкирующих
областей
3 5. Очистка и изучение свойств СОД из vi
i
3.5.1. Очистка СОД из М. ii
3.5.2. Молекулярные и каталитические свойства СОД 4 3 6. Изучение аэротолерантности метаногенных архей М. и М.
i
3 7. Изучение изменения удельных активностей каталазы и СОД
в ходе роста культур М. и М. ii ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Однако не так авно было обнаружено, что не все сульфатредукюры быстро погибают в эисутствии молекулярного кислорода, многие обладают достаточной эротолерантностью и выдерживают кратковременную экспозицию на воздухе, и гроятно, это является одним из важнейших факторов многообразия галогических ниш. Так, исследуя восемь видов сульфатредуцирующих бактерий, ипионка обнаружил среди них широкий диапазон чувствительности к кислороду i , Многие представители рода vii были выделены из рошо аэрируемых поворностных вод морей и озер . Петри они оставались живыми в атмосфере воздуха в течение суток ондратьева, , и даже после экспозиции на воздухе в течение месяца в лониях данного микроорганизма обнаруживались живые клетки . Кондратьева, , ii также обладает способностью к росту в микроаэрофильных условиях . Харди и Гамильтон показали, что клетки . Некоторые сульфатредукторы, в частности xi. Н7. Циклический процесс сульфатредукции и юкисления сульфида кислородом воздуха достаточно эффективен для 1еспечения сульфатредукторов энергетическими субстратами и уменьшения здействия кислорода на клетки . Более того, сравнительно недавно на vii i ыл открыт связанный с восстановлением до воды и окислением НАДН эоцесс потребления полиглюкозы в качестве энергетического субстрата с юстием НАДНрубредоксин и рубредоксимкислород оксидоредуктаз в качестве мпонентов элекгронтранспортной цепи. Показано однако, что vii . V, V. Есть также основания считать, что ассимиляционная сульфатредукция может осуществляться в присутствии юлорода i. Показано, что кислород оказывает жсическое воздействие на сульфатредукторов в достаточно низких нцентрациях, что обусловлено не только образованием реакционноспособных юизводных кислорода, но и, частично, его конкуренцией с сульфатом как щептором электронов i . Тем не менее, процесс деления клеток . При этом клетки приобретают удлиненную форму, их выживаемость Зко снижается. Морфологические изменения клеток после экспозиции на здухе наблюдали и в случае i i и vii ii II Известно, что кислород инактивирует многие ферменты льфатредуцирующих бактерий, в частности дегидрогеназы и ферменты таболизма, и приводит к блокировке процесса сульфатредукции , . Отмечено также поглощение некоторыми льфатредукторами . Метаногены считаются строжайшими анаэробами. М. таким образом кислород практически олностью отсутствует в местообитаниях метаногенов , . Но несмотря на то. Нх в присутствии кислорода, они могут быть достаточно толерэнтны по гношению к кислородному воздействию Первые данные по способности етаногенов родов i и i кратковременно греносить контакт с кислородом были получены сравнительно давно Жилина. Наиболее исчерпывающие исследования по учению токсичных эффектов пероксидов и других продуктов взаимодействия с юлородом на выживаемость метаногенов провели Кинер и Лезингер i, ii. Они показали, что жизнеспособность уменьшается в 0 раз юле ти часовой экспозиции на воздухе для выделенных из морских и озерных энных осадков v и viii. ДКМОСТИ, с формированием комков клеток Жилина. Полученные недавно данные . Представители рода 9i, выделенные из кишечника термитов , , 6 и гниющей сердцевины деревьев i, i, , где присутствуют робные зоны, также толерантны по отношению к кислороду от содержания в атмосфере. Таким образом, метаногены значительно отличаются по своей эствительности к кислороду. В настоящее время считается доказанным, что етаногены слособны существовать в местообитаниях, где присутствуют эробные микрозоны или временно возникают аэробные условия, таких, как эриодически осушаемые рисовые поля i, ii, , , 0, отложения тины на мелководьях i, ii. Существует ряд доказательств адаптации метаногенов к кислороду. Низкие ювни супероксиддисмутазы были найдены у метаногенов i . В случае экспозиции на воздухе формируется эфирная 1язь между фосфатной группой АМФ или ГМФ и 8гидроксигруппой азафлэвинового кольца в коферменте . Эти модифицированные кофакторы имеют максимумы поглощения оло 0 нм и поэтому называются 9 производными и они быстро реагируют . Эта дификация, возможно, участвует в переключении восстановительного таболизма в присутствии кислорода и.