Генотипирование штаммов Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei

• Автор: Савченко, Сергей Сергеевич
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 106 с. : 17 ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Внутривидовое типирование патогенных микроорганизмов на

основе фенотипических признаков

1.2. Использование молекулярногенетических методов для внутри

видового типирования возбудителей бактериальных инфекций

1.3. Дифференциация штаммов патогенных буркхольдерий с исполь зованием молекулярнобиологических методов

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы микроорганизмов, питательные среды, условия культивирования
2.2. Подготовка проб для ПЦР
2.3. Выделение ДНК
2.4. Полимеразная цепная реакция
2.4.1. Реакция амплификации с произвольными праймерами
2.4.2. Реакция амплификации со специфическими праймерами
2.4.3. Реакция амплификации для мультилокусного сиквснс типирования
2.5. Детекция продуктов амплификации и определение размеров фрагментов ДНК
2.6. Секвенирование продуктов амплификации и анализ полученных нуклеотидных последовательностей
2.7. Статистическая обработка результатов
2.8. Заражение лабораторных животных ГЛАВА 3. ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ТИПИРОВАНИЕ ШТАММОВ ПА ТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СЕКВЕНИРОВАНИЯ
3.1. Монолокусное типирование штаммов патогенных буркхоль
дерий с использованием секвенирования флагелляриого и рибосо
мальных генов
3.2. Мультилокусное сиквенстипирование штаммов патогенных
буркхольдерий.
ГЛАВА 4. ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ШТАММОВ ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ ПА ОСНОВЕ АМПЛИФИКАЦИИ С ПРОИЗВОЛЬНЫМИ ПРАЙМЕРАМИ КАРП
4.1. Стандартизация условий постановки реакции амплификации и подбор праймеров для ИАРОтипирования патогенных буркхольдерий.
4.2. Анализ генетического полиморфизма возбудителя сапа с ис пользованием произвольных праймеров.
4.3. ЯАРОтипирование штаммов возбудителя мелиоидоза
4.4. ЯАРОтипирование мутантных и выделенных от эксперимен тально зараженных животных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ


Несмотря на достигнутые успехи в области генотипирования, проблема определения штаммовой гетерогенности патогенных буркхольдерий попрежнему существует. Актуальность исследования обусловлена отсутствием единого мнения и регламентирующих документов для дифференциации штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза. Кроме того, основная масса исследований в области генотипирования патогенных буркхольдерий направлена на разработку схем внутривидовой дифференциации В. В.i имеются лишь единичные публикации 2, 1, 0, 3. Анализ геномного полиморфизма коллекционных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза и выбор оптимальных методов внутривидовой дифференциации патогенных буркхольдерий. Проанализировать нуклеотидные последовательности, представленные в доступных генетических базах данных, для выбора ДНКмишеней и проведения внутривидового тип ирования штаммов В. В. i с использованием монолокусного секвенирования. Оценить разрешающую способность метода мультилокусного сиквенстипирования для дифференциации штаммов патогенных буркхольдерий. Подобрать произвольные праймеры и оптимизировать условия проведения реакции амплификации для эффективной и воспроизводимой дифференциации штаммов В. В. i с использованием ГПДРтипирования , ПЦР. Впервые проведен анализ изолятов возбудителя сапа на основе реакции амплификации с произвольными праймерами и предложен оригинальный набор олигонуклеотидных затравок для дифференциации штаммов патогенных буркхольдерий. Впервые показана высокая эффективность метода для внутривидового типирования штаммов возбудителя сапа, в то время как для дифференциации штаммов возбудителя мелиоидоза мультилокусного сиквенстипирования и ПЦРтипирования , ПЦР. Использование алгоритма для анализа результатов мультилокусного сиквенстипирования позволило впервые установить, что штаммы коллекционного центра живых культур Волгоградского научноисследовательского противочумного института В. С1, а также В. ЮгоАзиатской группе. Оценена возможность использования фрагментов генов рРНК, рРНК и i в качестве ДНКмишеней для генотипироваиия возбудителей сапа и мелиоидоза и показана их низкая эффективность для дифференциации штаммов патогенных буркхольдерий. Выявлено, что сочетание реакции амплификации и последующего секвенирования фрагментов генов рРНК, рРНК и i является алгоритмом ускоренной идентификации В. В. i. Показано, что для повышения специфичности при идентификации патогенных буркхольдерий необходимо использовать секвенирование двух локусов геномной ДНК фрагмента гена рРНК и участков генов рРНК или i. ДНК патогенных буркхольдерий. Предлагаемые схемы ПЦРтипирования с выбранными наборами произвольных праймеров и мультилокусного сиквенстипирования используются в лабораториях Волгоградского НИПЧИ для анализа музейных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза и изучения генетически измененных штаммов патогенных буркхольдерий, а также могут быть востребованы для проведения эпидемиологического расследования вспышек сапа и мелиоидоза как при исследовании материала от больных, так и из объектов окружающей среды. Результаты, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, включены в лекционный материал, предназначенный для врачей, биологов и лаборантов учреждений санитарноэпидемиологического профиля и клинических диагностических лабораторий при проведении первичной специализации и курсов усовершенствования по вопросам специфической индикации и лабораторной диагностики особо опасных заболеваний, проводимых на базе ВолгоградНИПЧИ. По материалам диссертационной работы составлены методические рекомендации Молекулярнобиологические подходы к идентификации и внутривидовому типированию возбудителей сапа и мелиоидоза, утвержденные директором Волгоградского НИПЧИ г. Набор произвольных олигонуклеотидных затравок, обозначенных , 6, 7 и позволяет проводить внутривидовое типирование штаммов возбудителя сапа, а набор праймеров 7, , , и эффективен для дифференциации штаммов возбудителя мелиоидоза.