Генная диагностика легионеллеза с использованием полимеразной цепной реакции

• Автор: Портенко, Светлана Анатольевна
• Шифр специальности: 03.00.07, 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 161 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Характеристика возбудителя легионеллеза

1.2. Лабораторная диагностика легионеллеза

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Объекты исследования.

2.1.1. Бактериальные штаммы

2.1.2. Реактивы, питательные среды и диагностические препараты

2.2. Микробиологические методы

2.2.1. Культивирование микроорганизмов,
полученных из ГКПБ Микроб.
2.2.2. Выделение и идентификация гетероло ичных
микроорганизмов из клинического материала.
2.2.3. Подготовка проб.
2.2.4. Выявление возбудителя легионеллеза в пробах биологического материала и из объектов окружающей среды с помощью бактериологического анализа.
2.2.5. Идентификация культур i
2.2.6. Выявление растворимого антигена
. i серогруппы 1 в моче
2.2.7. Выявление в сыворотке крови иммуноглобулинов
к . i ссрофуипы 1, i i,
i, xi i методом
иммунофермеитного анализа.
2.2.8. Выявление в сыворотке крови иммуноглобулинов
к . i серогруппы 1 в реакции аггломерации РАО
2.3. Генетические методы
2.3.1. Обеззараживание проб для исследований методом ГИДР
2.3.2. Выделение ДНК из бактериальных суспензий, проб
биологического материала и объектов окружающей среды
2.3.3. Полимеразная цепная реакция.
2.4. Клонирование ПЦРпродукта в вектор
2.4.1. Очистка ампликонов.
2.4.2. Клонирование в вектор
2.4.3. Культивирование рекомбинантных штаммов Е. i I
2.4.4. Выделение плазмидной ДНК рекомбинантного
штамма Е. i I.
2.5. Определение концентрации ДИК.
2.6. Программы и базы данных для анализа нуклеотидных последовательностей.
2.7. Статистическая обработка полученных данных.
Глава 3. ПОДГОТОВКА ВЫБОРКИ ШТАММОВ
. I И ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧНОСТИ И СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ГЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ ЛЕГИОНЕЛЛЕЗА
3.1. Подбор гетсрологичных штаммов микроорганизмов
3.2. Подбор специфичных штаммов микроорганизмов.
3.3. Подготовка выборки штаммов . i и гетсрологичных микроорганизмов для определения специфической активности
и специфичности тестсистем, направленных на индикацию
и идентификацию возбудителя легионеллеза
ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА ПЦР ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК
ВОЗБУДИТЕЛЯ ЛЕГИОНЕЛЛЕЗА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ, ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ И ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ШТАММОВ . I
4.1. Выбор ДНКмишеней
4.2. Подбор олигонуклеотидных праймеров и зондов, оптимизация условий проведения ПЦР с электрофоретическим и
гибридизациоинофлуоресцентпым учетом результатов.
ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА ТЕСТСИСТЕМ ДЛЯ ИНДИКАЦИИ
И ИДЕНТИФИКАЦИИ . I МЕТОДОМ Г1ЦР С ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИМ И ГИБРИДИЗАЦОННОФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ УЧЕТОМ
РЕЗУЛЬТАТОВ
5.1. Конструирование тестсистем для выявления ДНК возбудителя легионеллеза в биологическом материале и объектах окружающей среды методом П1ДР с электрофоретическим и гибридизационнофлуоресцентиым учетом результатов
5.2. Конструирование тестсистем для идентификации штаммов . i методом ПЦР с электрофоретическим и гибридизационнофлуоресцеитным учетом результатов
5.3. Изучение диагностической ценности разработанных тестсистем для выявления возбуди геля легионеллеза в биологическом материале и объектах окружающей среды и для идентификации штаммов
. i методом ПЦР с электрофоретическим и
гибридизациионнофлуоресцентным учетом результатов.
Глава 6. АПРОБАЦИЯ СКОНСТРУИРОВАННЫХ
ТЕСТСИСТЕМ НА ПРОБАХ ИЗ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ, РАЗРАБОТКА АЛГОРИТМА ГЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ ЛЕГИОНЕЛЛЕЗА.
6.1. Апробация сконструированных тестсистем на пробах из биологического материала и объектов окружающей среды
6.2. Алгоритм генной диагностики легионеллеза.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Содружества Независимых Государств Оболенск, IX съезде Зсероссийского научнопрактического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения Российской Федерации Москва, VIII Межгосударственной научнопрактической конференции государствучастников СНГ Международные медикосанитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государстваху частин ков СНГ Саратов, Международной научнопрактической конференции Молекулярная диагностика инфекционных болезней Минск, 6ой Всероссийской научнопрактической конференции с международным участием Молекулярная диагностика Москва, . Основное содержание работы отражено в научных публикациях, из них 1 в рекомендованном ВАК издании. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы, включающего отечественных и 1 зарубежных источников. Общий объем работы составляет 1 страницы компьютерного текста, иллюстрированного таблицами и рисунками. ГЛАВА 1. Возбудители легионеллеза широко распространнные в природе бактерии, принадлежащие к роду i, семейству i, уподтипу протсобактерий. К настоящему времени выделено и описано около видов легионелл, для из которых доказана роль в инфекционной патологии человека . На основании анализа генов рРНК установлена значительная степень генетического сходства между видами легионелл , . Подавляющее большинство случаев легионеллеза до связано с видом . Представители всех сероваров . Другие виды легионелл, такие как, . ВИЧинфекцией, иммуиосупрессивной терапией или другими причинами i . V, , i . Помимо этого, выделяют группу так называемых iподобных амебных патогенов. В лабораторных условиях их выращивают в культурах свободноживущих пресноводных амеб . В. . К настоящему времени данные о клинической значимости iподобных амебных патогенов отсутствуют. Легионеллы представляют собой грамотрицательные палочки диаметром 0,,9 мкм и длиной мкм, в ряде случаев до мкм. Не образуют эндоспор и микроцист. Некоторые виды легионелл продуцируют внешнюю мукополисахаридную капсулу И. Как установлено, размножение этих бактерий происходит путем образования перетяжки. Большинство видов легионелл подвижны за счет одного или нескольких жгутиков, прикрепленных к одному из полюсов клетки. Лсгионеллы обладают дыхательным типом метаболизма, используя в качестве конечного акцептора электронов кислород i В. Структура клеточной стенки легионелл в целом характерна для грамотрицателыплх бактерий. Отличия заключаются в более высоком содержании фосфолипидов и качественном составе жирных кислот до составляют соединения с разветвленными боковыми цепями. Помимо этого, в цитоплазме легионелл содержится большое количестве рибосом и хромосома в виде нитевидных элементов . Являясь хемоорганотрофами, легионеллы не обладают способностью окислять и сбраживать углеводы, а в качестве источника энергии и питательных веществ используют аминокислоты, в первую очередь, цистеин i . Помимо этого, также фактором роста для них являются растворимые ионы железа. В связи с этим, в состав питательных сред для выделения и культивирования возбудителя легионеллеза обязательно входят такие компоненты, как цистеин, дрожжевой экстракт и пирофосфат железа . Ы2ацетамидо2аминоэтансульфоиовая и кетоглутаровая кислоты, способствующие лучшему усвоению цистсииа легионеллами i Р. П., . Большинство видов легионелл характеризуются сходными культуральными и биохимическими свойствами. Поскольку легионеллы обладают слабой биохимической активностью, они не образуют урсазу, не восстанавливают нитраты, обладают каталазопероксидазной активностью, результаты оксидазного теста могут варьировать. Практически все штаммы легионелл разжижают желатину, гидролиз гипнурата характерен для представителей большинства серогрупп вида . II I , . Геном легионелл представлен хромосомой, размер которой может варьировать от до т. Содержание ГЦ пар составляет . Сравнение трех секвенированных геномов .