Генетические детерминанты патогенности клинических штаммов Klebsiella pneumoniae

• Автор: Фиалкина, Светлана Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 140 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Этиологическая роль i i в инфекционной

патологии человека

1.2. Факторы патогенности энтеробактерий

1.2.1. Факторы патогенности i i

1.2.2. Факторы патогенности других условнопатогенных энтеробактерий 1.3. ПЦР в идентификации патогенных бактерий и диагностике инфекционных заболеваний

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Используемые штаммы, среды

2.2. Характеристика эталонных штаммов
2.3. Полимеразная цепная реакция
2.3.1. Подготовка проб
2.3.2. Амплификация ДНК
2.3.3. Детекция результатов ПЦР
2.4. Биологические методы исследования
2.4.1. Количественная оценка адгезивной активности
2.4.2. Определение гемолитической активности
2.4.3. Определение ДНКазной и РНКазной активности
2.4.4. Определение казеинолитической активности
2.4.5. Определение антилизоцимной активности
2.4.6 Определение энтсрогемолитической активности
2.4.7. Изучение адгезии на модели культуры клеток
2.4.8. Изучение цитотоксического некротизирующего фактора на модели клеточных линий V и
2.4.9. Изучение гемагпотинирующей способности
2.4 Определение вирулентности штаммов .i при внутрибрюшинном заражении белых мышей
. 2.5. Серологическое типирование .i
2.6. Определение чувствительности к антибиотикам
2.7. Методы статистического анализа
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Коллекция клинических штаммов i i и их общая
характеристика
3.2. Характеристика биологических свойств клинических изолятов i i
3.3. Изучение нуклеотидных последовательностей генов, обеспечивающих адгезию i i на эпителии
3.3.1. Определение нуклеотидных последовательностей генов, контролирующих синтез фимбрий , Р и 1 типа у клинических штаммов i i
3.3.2. Определение нуклеотидных последовательностей еаеА гена у клинических штаммов К.i
3.4. Изучение адгезии штаммов i i на клеточных
линиях
3.5. Изучение генетических детерминант, обеспечивающих размножение возбудителя в тканях
3.6. Изучение генетических детерминант токсинообразования у клинических штаммов i i
3.6.1. Обнаружение нуклеотидных последовательностей 1 гена у клинических штаммов i i
3.6.2. Обнаружение нуклеотидных последовательностей генов, контролирующих синтез шигаподобных энтеротоксинов 1 и 2 типа, у штаммов i i
3.6.3. Определение генетических детерминант, контролирующих синтез гемолизинов, у клинических штаммов i i
3.7. Частота встречаемости нуклеотидных последовательностей генов патогенности у клинических изолятов .i
3.8. Фенотипическая экспрессия факторов патогенности i i
3.8.1. Энтерогемолитическая активность клебсиелл
3.8.2. Гемолитическая активность клебсиелл
3.8.3. Фенотипическая экспрессия цитотоксического некротизирующего фактора1
3.8.4. Гемагглютинирующая активность .i
3.9. Оценка патогенности клинических штаммов i i i viv
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


У клинических изолятов i i впервые обнаружены нуклеотидные последовательности генов, обеспечивающих адгезию возбудителя рарС, рарН, , , , i гены, размножение в тканях i2 ген и продукцию токсинов , x, , x2. Частота встречаемости нуклеотидных последовательностей генов, контролирующих синтез факторов патогенности, у клинических штаммов i i составила ,8. Подобраны праймеры, амплифицирующие консервативные участки генов, контролирующих синтез факторов патогенности энтеробактерий, и оптимизированы условия их амплификации. Показана корреляция между присутствием в геноме штаммов клебсиелл нуклеотидных последовательностей генов, детерминирующих синтез факторов патогенности, и экспрессией адгезинов, агемолизина, энтерогемолизина, цитотоксического некротизирующего фактора 1. Праймеры могут быть использованы для типирования внутрибольничных штаммов клебсиелл с целью установления источника происхождения изолятов. За неоценимую помощь при выполнении работы автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю заведующему лабораторией генетики вирулентности бактерий ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, проф. В.М. Бондаренко и всем сотрудникам лаборатории. Автор благодарит в. НИИ им. Д.И. Ивановского, к. Михайлову Г. Р. за консультации и помощь при выполнении экспериментов на клеточных линиях. ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. В настоящее время приобретают все большее медицинское значение условнопатогенные энтеробактерии, к числу которых принадлежат клебсиеллы. Исследования последних лет показывают присутствие у клебсиелл факторов патогенности, участвующих в различных этапах инфекционного процесса 2, 7. Однако, лабораторная диагностика, базирующаяся на классическом способе обнаружения клебсиелл бактериологическим методом, не дает возможности судить о патогенетическом потенциале выделенных штаммов, и, соответственно, делать вывод об их этиологической роли, особенно при микстинфекции. Необходимость анализа факторов патогенности выделенных штаммов обусловлена широким спектром острых и хронических инфекционных заболеваниях, при которых изолируются клебсиеллы. Клебсиеллы являются этиологическим агентом при пневмонии, инфекциях мочеполовой системы, острых желудочнокишечных заболеваний, различных гнойносептических осложнениях, а также при менингите, эндокардите, глазных инфекциях, анкилозирующем спондилите, полиартрите,, , , 5, 1, 4. Штаммы, изолированные при таких инфекциях, обладают сходным набором факторов патогенности с клиническими изолятами 7, 1. Особое место занимают клебсисллы как возбудители внутрибольничных инфекций. Причем представители рода i занимают одно из первых мест среди этиологических агентов. Клебсисллы выделены при внутрибольничных инфекциях с различной клинической картиной. Чаще других при госпитальных инфекциях выделяют i i 1, 8, , . В связи с этим подчеркивается необходимость контроля за развитием клебсиеллеза в родильных домах с применением компьютерных технологий . Чаще всего внутрибольничные инфекции вызывают полирезистентные штаммы клебсиелл 4,. По данным литературы долю i i приходится от до всех случаев сепсис у новорожденных, смертность при которых достигает . Так, исследования, проведенные на базе Омского городского клинического перинатального центра ГКПЦ по оценке гнойносептической заболеваемости детей в неонатальном периоде за гг. Наиболее часто госпитальная гнойносептическая инфекция присоединялась к основному заболеванию на 7 день пребывания больных детей в стационаре. Из взятых проб у новорожденных чаще всего изолировали . Так же эти микробы выссвасмости из объектов окружающей среды в данном стационаре. Они могут встречаться как в ассоциации с другими микроорганизмами . Так, частота инфекций, вызванных . У пациентов отделений интенсивной терапии количество инфекций, вызванных . На первое место выходят клебсиеллы в качестве причины инфекций мочевыводящих путей у больных, страдающих сахарным диабетом 3. Бактерии рода i способны поражать и дыхательный тракт, где наблюдаются острые респираторные заболевания и пневмонии, иногда с деструкцией легочной ткани и развитием абсцессов.