Влияние структуры липополисахарида на устойчивость Yersinia pestis к бактерицидному действию катионных антимикробных пептидов и комплемента сыворотки

• Автор: Титарева, Галина Михайловна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 155 с. : 13 ил.

ВВЕДЕНИЕ

Глава . 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О ВОЗБУДИТЕЛЕ ЧУМЫ

1.2. ЛИПОПОЛИСАХАРИДЫ ОСНОВНОЙ КОМПОНЕНТ ВНЕШНЕЙ МЕМБРАНЫ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ

1.3. ВРОЖДЕННЫЙ ИММУНИТЕТ

1.3.1. КАТИОННЫЕ АНТИМИКРОБНЫЕ ПЕПТИДЫ

1.3.2. СИСТЕМА КОМПЛЕМЕНТА

1.4. ЛПС И УСТОЙЧИВОСТЬ К БАКТЕРИЦИДНОМУ ДЕЙСТВИЮ КАТИОННЫХ ПЕПТИДОВ

1.5. ЛПС И УСТОЙЧИВОСТЬ К БАКТЕРИЦИДНОМУ ДЕЙСТВИЮ СЫВОРОТКИ КРОВИ

1.6. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ БИОСИНТЕЗА ЛПС И ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТРУКТУР, ОТВЕЧАЮЩИХ ЗА УСТОЙЧИВОСТЬ К ДЕЙСТВИЮ КАТИОННЫХ ПЕПТИДОВ И СЫВОРОТКИ

1.7. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. ШТАММЫ МИКРООРГАНИЗМОВ
2.2. ПЛАЗМИДЫ
2.3. СРЕДЫ И УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
2.4. ГЕННОИНЖЕНЕРНЫЕ МЕТОДЫ
2.5. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ, ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ДСНПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ
2.6. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ У. I К ДЕЙСТВИЮ ФАКТОРОВ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА
2.6.1 ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ С КАТИОННЫМИ ПЕПТИДАМИ
2.6.1.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИНИМАЛЬНОЙ
ПОДАВЛЯЮЩЕЙ КОНЦЕНТРАЦИИ МПК
ПОЛИМИКСИНА В
2.6.1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СВЯЗЫВАНИЯ
ПОЛИМИКСИНА В С ЖИЗНЕСПОСОБНЫМИ
БАКТЕРИАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ И ПРЕПАРАТАМИ ЛИС
2.6.2 ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЖИВЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК У I С НОРМАЛЬНОЙ
И ИММУНОЙ ЧЕЛОВЕЧЕСКОЙ И МЫШИНОЙ СЫВОРОТКОЙ.
2.7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КОМПЛЕМЕНТА
2.8. ОПСОНИЗАЦИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК
КОМПОНЕНТАМИ КОМПЛЕМЕНТА НОРМАЛЬНОЙ ЧЕЛОВЕЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ
2.9. ОЦЕНКА СВЯЗЫВАНИЯ КОМПОНЕНТА СЗ С БАКТЕРИАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ И ПРЕПАРАТАМИ ЛПС
2.9.1. ОЦЕНКА СВЯЗЫВАНИЯ КОМПОНЕНТА СЗ С БАКТЕРИАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ И ПРЕПАРАТАМИ ЛПС МЕТОДОМ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА
2.9.2. ОЦЕНКА СВЯЗЫВАНИЯ КОМПОНЕНТА СЗ С БАКТЕРИАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ И ПРЕПАРАТАМИ ЛПС ДОТБЛОТ АНАЛИЗОМ
2 МЕТОДЫ СТАТИСТИЧЕСКОЙ ОБРАБОТКИ
РЕЗУЛЬТАТОВ
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
ГлаваЗ. ИЗУЧЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ У. I К БАКТЕРИЦИДНОМУ ДЕЙСТВИЮ ПОЛИМИКСИНА В
3.1.СРАВНЕНИЕ УРОВНЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ПОЛИМИКСИНУ В ШТАММОВ .I В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ К ПОДВИДУ И ТЕМПЕРАТУРЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
3.2.ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПОСОБНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ
КЛЕТОК У. I И ПРЕПАРАТОВ
ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ СВЯЗЫВАТЬ полимиксин в
3.3. ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА ШТАММА I8 .I ВЫРАЩЕННОГО ПРИ ТЕМПЕРАТУРЕ С В ПРИСУТСТВИИ ПОЛИМИКСИНА В
3.4. ОБСУЖДЕНИЕ.
Глава 4. ИЗУЧЕНИЕ БАКТЕРИЦИДНОГО ДЕЙСТВИЯ
СЫВОРОТКИ КРОВИ I .I
4.1.ИЗУЧЕНИЕ УРОВНЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ЛАБОРАТОРНЫХ ШТАММОВ У. I К БАКТЕРИЦИДНОМУ ДЕЙСТВИЮ СЫВОРОТКИ.
4.2. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ЛПС НА МЕХАНИЗМЫ УСТОЙЧИВОСТИ К БАКТЕРИЦИДНОМУ ДЕЙСТВИЮ СЫВОРОТКИ ЛАБОРАТОРНЫХ ШТАММОВ У. I.
I 4.3. ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 5. ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ЗНАЧИМОСТИ ГЕНОВ 0 УЧАСТВУЮЩИХ В РАЗНЫХ СТАДИЯХ БИОСИНТЕЗА ЛПС НА ОСНОВЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ ИЗОГЕННЫХ МУТАНТОВ У I.
5.1.КОНСТРУИРОВАНИЕ ИЗОГЕННОЙ СИСТЕМЫ 0 ШТАММОВ I С ДЕФЕКТАМИ НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ БИОСИНТЕЗА ЛПС
5.2. АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ 3 ШТАММОВ С МУТАЦИЯМИ ПО ГЕНАМ 7, I6, , И 1. НА ОСНОВЕ
Ш ТАММА КМ0 . I
5.3. ВЛИЯНИЕ МУТАЦИЙ В ОБЛАСТИ ГЕНОВ, 9 УЧАСТВУЮЩИХ В БИОСИНТЕЗЕ ЛПС . I, НА ИЗМЕНЕНИЕ УРОВНЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ПОЛИМИКСИНУВ И БАКТЕРИЦИДНОМУ ДЕЙСТВИЮ СЫВОРОТКИ
5.4. ОБСУЖДЕНИЕ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ


Механизмы иммунной защиты представлены с одной стороны системой врожденного иммунитета наиболее ранним ответом на инфекцию, действующим немедленно после внедрения патогена, а с другой стороны системой приобретенного иммунитета, который включается в более поздней стадии и является антигенспецифическим. Система врожденного иммунитета, являясь эволюционно наиболее древней, действует путем воспалительных реакций и фагоцитоза. Патогенные бактерии, попадая в организм млекопитающего, могут быть либо быстро уничтожены, либо, преодолев барьер неспецифической иммунной защиты, привести к развитию заболевания iv, . В процессе эволюции отношений микро и макроорганизма у бактериальных патогенов, в частности у патогенных иерсиний, появились механизмы устойчивости к факторам врожденного иммунитета, что позволяет им выживать и размножаться в организме хозяина Анисимов, а, , . Существуют различные механизмы устойчивости к бактерицидному действию сыворотки , i . Бактерицидные свойства сыворотки определяются, в основном, системой комплемента. Устойчивость к бактерицидной активности сыворотки У. Оантигеном i . Для . Анисимов, а, , i . Действительно, большая часть штаммов чумного микроба обладает резистентностью к бактерицидному действию сыворотки. У. i, но до сих пор не установлены е механизмы. Наряду с устойчивыми к действию сыворотки штаммами У. Гвозденкос соает. Другим фактором неспецифической иммунной защиты являются антимикробные катионные пептиды, обнаруженные во многих тканях и клетках млекопитающих , i . В основе антимикробного действия катионных пептидов лежат электростатические взаимодействия с анионными участками липида А. Кроме того показано, что катионные пептиды могут значительно снижать эндотоксический эффект ЛПС . Изучение механизма антиэндотоксичсского действия катионных пептидов свидетельствует, что они имеют более высокое сродство к ЛПС по сравнению с сывороточным белком , , и, таким образом, препятствуют связыванию ЛПС с , , , . Некоторые виды иерсиний, такие как i, . Одним из механизмов такой устойчивости может являться модификация липида А за счет присоединения 4амино4дезоксиЬарабинозы 4 к четвертому иили первому фосфату i, i . Наряду с резистентными к действию полимиксина В штаммами . Мартиневский с соавт. Недавно были опубликованы результаты всестороннего анализа структуры ЛПС синтезируемых разными штаммами . Ь. Тем не менее, установление роли отдельных структурных компонентов ЛПС в устойчивости . Выявление молекулярных механизмов резистентности к факторам врожденного иммунитета может объяснить причины избирательной вирулентности неосновных подвидов . ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ получение новых данных о функциональной значимости отдельных структурных компонентов ЛИС У реэШ в устойчивости к бактерицидному действию антимикробных пептидов и комплемента сыворотки. Изучить уровни чувствительности к бактерицидному действию полимиксина В и сыворотки крови у представителей разных внутривидовых групп У. Ш, выращенных в температурном диапазоне от 5 С до С, и сопоставить их с данными о химической структуре ЛПС. Оценить степень связывания полимиксинаВ живыми клетками У ревИБ и препаратами ЛПС в зависимости от его структуры. Определить степень участия альтернативного и классического путей активации комплемента в реализации бактерицидного действия сыворотки на разные штаммы У. Нэ изучить связывание СЗ компонента комплемента с клетками У. Ш и с препаратами ЛПС. Создать на основе штамма основного подвида У реяШ КМ0 коллекцию изогенных нокаутных мутантов, отличающихся по степени редуцированности молекулы ЛПС. Охарактеризовать функциональное значение некоторых генов участвующих в процессе биосинтеза ЛПС. НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Установлено, что культивирование У реБШ при 6 С, соответствующей температуре зимней спячки грызунов, сопровождается изменением структуры ЛПС, что приводит к увеличению чувствительности микробных клеток к бактерицидному действию КАМП и сыворотки. Определены минимальные подавляющие концентрации МПК КАМП полимиксина В РМВ для штаммов У реяНй, выращенных при температурах от 5 С до С. Показано, что максимальная устойчивость к РМВ для разных штаммов находится в различных температурных диапазонах. Показано впервые, что гены У.