Биоразнообразие диазотрофов почв с различной антропогенной нагрузкой

• Автор: Задорина, Елена Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 135 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В РАБОТЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Глава 1. Азотфнкснрующис микроорганизмы

1.1. Значение биологической фиксации атмосферного азота.

1.2. Азотфикаторы и сельское хозяйство

1.3. Некоторые аспекты строения и регуляции нитрогеназпого комплекса.

1.4. Ген пП. как молекулярный маркер для дегекци

т идентификации диазотрофов.

Глава 2. Методы исследования почвенных микробных сообществ

2.1. Традиционные микробиологические методы исследования.

2.2. Биохимические методы исследования.
2.2.1. Определение активности почвенных ферментов
и почвенного дыхания
2.2.2. Изучение физиологического профиля сообщества.
2.2.3. Анализ жирных кислот фосфолипидов
2.2.4. Изучение функциональной активности микроорганизмов.
2.3. Молекулярнобиологические методы исследования.
2.3.1. Методы определения содержания гуанина и цитозина.
2.3.2. ДНК реассоциация и гибридизация нуклеиновых кислот.
2.3.3. Методы, основанные на ПЦР
2.3.3.1. Анализ с помощью градиентного гельэлектрофореза
2.3.3.2. Анализ на основе рестриктазной обработки ПЦРфрагментов
2.3.3.3. ПЦР со специфичными праймерами
2.3.3.4. Методы ЮБА, КАРП и ПАР
2.3.4. Методы, основанные на анализе первичных последовательностей нуклеиновых кислот
2.3.4.1. Подход на основе анализа генов рРНК.
2.3.4.2. Подход на основе анализа функциональных генов.
2.3.5. Факторы, влияющие на точность молекулярных исследований
2.3.5.1. Выделение нуклеиновых кислот
2.3.5.2. Ограничения полимеразной цепной реакции.
2.3.5.3. Ограничения метода клонирования.
2.3.5.4. Ограничения анализа ДНКфингерпринта
2.3.5.5. Ограничения методов т зчи гибридизации.
2.4. Статистические методы анализа.
Глава 3. Азотфиксапня в болотных экосистемах
Глава 4. Биотехнологические раст ения.
4.1. Производство биотехнологических растений в Мире.
4.2. Роль биотехнологических растений в практике сельского хозяйства.
4.2.1. Растения, устойчивые к фитопатогенным грибам
и бактериям.
4.2.2. Растения, устойчивые к иасекомымвредителям, вирусам
и гербицидам
4.2.3. Растения, противостоящие неблагоприятным воздействиям окружающей среды
4.3. Биобезопасность генетически модифицированных растений.
4.3.1. Нормативные правовые акты в области оценки биобезопасности генетически модифицированных организмов.
4.3.2. Основные виды рисков и оценка биологической опасности биотехнологических растений.
4.3.3. Мониторинг изменений в структуре микробных сообществ
почв при оценке риска биотехнологических растений.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Глава 5. Материалы и методы исследования
5.1. Объекты исследования
5.2. Получение препаратов ДНК из почвенных образцов
5.3. Амплификация исследуемых генов
5.3.1. Амплификация фрагментов гена 8 рРНК
с использованием праймеров, специализированных для РОСЕ.
5.3.2. Амплификация фрагментов гена шН.
5.3.2.1. ПЦР с использованием универсальных праймеров
5.3.2.2. ПЦР с использованием специфичных для представителей
рода ОзсШосМогм праймеров.
5.3.2.3. ПЦР с использованием специфичных праймеров для детекции представителей метано грофных бактерий типа
5.4. Очистка ПЦРфрагмснтов
5.5. Клонирование ПЦРфрагментов
5.5.1. Приготовление компетентных клеток.
5.5.2. Лигирование.
5.5.3. Трансформация клеток плазмидной ДНК.
5.5.4. Выделение плазмидной ДИК
5.6. Секвенирование.
5.7. Анализ полученных последовательностей
5.8. Статистический анализ
5.9. Денатурирующий градиентный гельэлсктрофорез.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
Глава 6. Оценка биоразнообразия дпазотрофов в образце торфяной почвы естественной экосистемы верхового болота.
6.1. Выделение ДНК и амплификация фрагментов гена тН
6.2. Анализ библиотек клонов фрагментов гена тН
6.3. Статистический анализ
6.4. Анализ диазотрофного сообщества с помощью специфичных праймеров
6.4.1. Проверка специфичности системы праймеров для представителей
рода ОзсШосЬЬпб и ее применение в исследовании торфяной почвы
6.4.2. Проверка специфичности системы праймеров для представителей родов i н МеММогпопаз, и ее применение в исследовании торфяной почвы.
Глава 7. Оценка биоразнообразия дпазотрофов в образцах почв, отобранных из ризосфер контрольных и биотехнологических растений картофеля
7.1. Выделение ДНК и амплификация генов тН и Б рРНК
7.2. ОСОЕанализ суммарного амплификата фрагментов гена Б рРНК
7.3. Анализ клонов фрагментов гена пН.
7.4. Статистический анализ.
Глава 8. Сравнение структур дназотрофных сообществ торфяной почвы
и ризосферы картофеля
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
ВВЕДЕНИЕ


Плодородная почва обеспечивает высокую урожайность растений за счет наличия в ней сбалансированного количества всех необходимых питательных веществ поддерживает разнообразное и активное биотическое сообщество . В естественных экосистемах вес звенья биогеохимического цикла азота находятся в сбалансированном состоянии, обеспечивая высокую продуктивность биогеоценозов. В агросистемах этот баланс нарушен вследствие частых обработок почвы и выноса азота с урожаем Умаров, . Существуют данные, что нарушения, вследствие таких сельскохозяйственных обработок, как вспашка, внос удобрений, применение различных веществ для защиты растений, могут привести к изменению структуры сообществ . Поэтому, все больший интерес в последнее время представляют исследования по изучению микроорганизмов, способствующих повышению плодородия почвы, стимулирующих потребление растениями питательных веществ и обеспечивающих защиту растений от болезней. В этой связи как для сельского хозяйства, в частности, так и для понимания различных процессов в экосистемах в целом, приобретает значение изучение структуры сообщества азотфиксаторов и динамики самого процесса i . Осуществляясь, преимущественно за счет энергии Солнца, биологическая азотфиксация предстает в качестве экологически чистого источника азота для обеспечения быстрорастущих нужд сельского хозяйства в условиях ограниченных запасов невозобновляемых энергетических ресурсов Умаров, . Наиболее перспективными направлениями решения проблем являются разработка альтернативных путей обеспечения небобовых растений доступным азотом за счет формирования искусственных симбиозов с азотфнксаторами Умаров, , поиск новых микробпорастительньтх диазотрофных сообществ, создание с помощью методов генетической инженерии азотфиксирующих растений, а так же разработка эффективных азотных удобрений на основе естественных бактериальных сообществ азотфиксаторов Игнатов. Все это требует хорошего знания вопросов, связанных с количественными оценками, определением видового разнообразия и структуры диазотрофного сообщества И применение молекулярнобиологических методов на основе анализа генов нитрогеназного комплекса представляется в этой связи весьма ценным. Азотфиксация представляет собой процесс восстановления атмосферного азота до аммиака, осуществляемый некоторыми симбиотическими, свободноживущими и ассоциативными микроорганизмами ix , . Ферментная система, катализирующая эту реакцию, получила название иитрогепаза Игнатов, . Нитрогеназы комплекс металлосодержащих ферментов с консервативными структурными особенностями рис. Эти ферменты состоят из двух обратимо диссоциирующих компонентов первый, болсс крупный, дини грогеназа МоГебелок. АТФзависимым облигатным донором электронов для первого компонен та ix , . Большинство диазотрофов имеют молибденовожелезную нитрогеназную систему, содержащую в активном центре, и являющуюся продуктом i Однако в условиях недостатка молибдена у некоторых микроорганизмов, к примеру viii и , индуцируется синтез альтернативных нитрогеназ, содержащих ванадий вместо молибдена в качестве кофактора V или только железо кофактор. Оба компонента этих нитрогеназ чрезвычайно чувствительны к кислороду ix , . Хотя недавно у i была обнаружена нитрогеназа, не чувствительная к действию кислорода. О2 до суперокеид анионрадикала 2 и марганецзависимой оксидорсдуктазы, которая окисляет обеспечивая перенос электронов на 2 и восстановление активного центра Ii , . Чувствительность к кислороду белка, являющегося продуктом гена iИ нитрогеназы, определяется наличием поверхностно расположенного кластера , который находится между двумя идентичными субъединицами у2 димера молекулярной массы кДа . Помимо этого единственного кластера белок содержит два сайта связывания с АТФ по одному на каждой субъединице Ii , , после присоединения которой белок приобретает способность служить донором электронов для первого компонента нитрогеназы белка Берцова и др. Да является тетрамером, состоящим из двух пар различных субъединиц , кодируемых генами i и i Ii , .