Биологическая характеристика бактериальных штаммов-активных продуцентов нитрилгидролизующих ферментов

• Автор: Козлов, Сергей Васильевич
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Пермь
• Количество страниц: 139 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИЙ,

МЕТ АБОЛ ИЗИРУ ЮЩИХ НИТРИЛЫ

1.1. Поступление нитрилов в окружающую среду

1.2. Пути метаболизма нитрилов

1.3. Микроорганизмы, экспрессирующие нитрилгидролизующие ферменты

1.4. Структура, свойства и условия экспрессии ферментов метаболизма нитрилов

1.5. Механизмы ферментативного гидролиза нитрилов

1.6. Генетические исследования продуцентов нитрилгидролизующих ферментов

1.7. Практическое использование микроорганизмов, конвертирующих нитрилы карбоновых кислот
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Бактериальные штаммы
2.2. Среды для культивирования и субстраты
2.3. Методы выделения бактерий, гидролизующих нитрилы
2.4. Условия культивирования бактерий и определение ростовых характеристик
2.5. Методы таксономического анализа
2.6. Определение минимальных ингибирующих концентраций
нитрилов
2.7. Изучение влияния индукторов на активность ферментов
2.8. Биотрансформация нитрилов
2.9. Определение активности ферментов
2 Г азовая хроматография
2 Высокоэффективная жидкостная хроматография ВЭЖХ
2 Получение концентрированных растворов акрилата аммония
2 Приготовление бесклеточного препарата
2 Определение влияния температуры, реакционной среды и ингибиторов на активность ферментов
2 Выделение ДНК
2 Полимеразная цепная реакция
2 Оценка биологической безопасности бактерий
2 Статистическая обработка ГЛАВА 3. ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА КУЛЬТУР
БАКТЕРИЙ, ОБЛАДАЮЩИХ НИТРИЛГИДРОЛИЗУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТЬЮ
3.1. Выделение нитрилгидролизующих бактерий
3.2. Идентификация бактериальных культур
3.3. Амплификация генов нитрилазы и нитрилгидратазы
3.4. Определение биологической безопасности Р. Аиогейсет С2 ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ РОСТА И
НИТРИЛГИДРОЛИЗУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ИЗУЧАЕМЫХ КУЛЬТУР БАКТЕРИЙ, ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ИХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
4.1. Зависимость активности клеток от фазы роста
4.3. Использование нитрилов в качестве ростовых субстратов
4.4. Использование нитрилов в качестве индукторов
4.5. Утилизация ацетонитрила
4.6. Влияние условий культивирования на рост и нитрилазную активность Р. Аиогезсею С2
4.7. Гидролиз нитрилов нитрилазой штамма Р. Аиогеьсет С2
4.8. Влияние условий культивирования на рост и нитрилгидролизующую активность К. егуМгороШ Р1а
4.9. Гидролиз нитрилов штаммом К. егуЛгороШ Р1 а
4 Влияние условий культивирования на рост и нитрилгидролизующую активность Я. егуМгороШ РЗ
4 Г идролиз нитрилов штаммом Я. егуМгороШ РЗ ГЛАВА 5. ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕРМЕНТОВ МЕТАБОЛИЗМА
НИТРИЛОВ
5.1. Влияние температуры на активность ферментов
5.2. Влияние реакционной среды
5.3. Влияние ингибиторов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Исследовать влияние факторов среды на активность нитрилгидролизующих ферментов и подобрать оптимальные условия культивирования биопродуцентов. Оценить возможность использования активных биопродуцентов нитрилгидролизующих ферментов для получения акриловой кислоты. Научная новизна. Выделены чистые культуры бактерий, обладающие высокой активностью нитрилгидролизующих ферментов, и идентифицированы на основании физиологобиохимических, хемо и генотаксономических характеристик как представители и i. Установлено отсутствие факторов патогенности у штамма . С2, обладающего высокой нитрилазной активностью. . С2 подтверждено наличие гена нитрилазы, а у штаммов генов зависимой нитрилгидратазы. Показано, что нитрилаза . устойчивости. Для экспрессии этого фермента не требуется добавление индуктора в ростовую среду. Обнаружено, что штамм . Разработаны протоколы полимеразной цепной реакции, позволяющие дифференцировать наличие нитрилазной системы метаболизма нитрилов от нитрилгидратазноамидазной или обнаруживать совместное их присутствие. Теоретическое и практическое значение работы. Расширен спектр детально охарактеризованных культур бактерий, конвертирующих нитрилы до соответствующих карбоновых кислот. На основе разработанных праймеров предложен эффективный способ обнаружения генов, кодирующих нитрилазные ферменты. Показана возможность использования изученных бактериальных штаммов для разработки эффективных биокатализаторов биотехнологического процесса получения акриловой кислоты. Выделенные штаммы бактерий также могут быть использованы для создания биосенсоров и применения в биотехнологии очистки объектов окружающей среды, загрязненных органоцианидами. Выделены и идентифицированы штаммы бактерий, обладающие высокой активностью нитрилгидролизующих ферментов и трансформирующие алифатические и ароматические нитрилы в соответствующие карбоновые кислоты. Нитрилаза штамма Р. Аиогезсет С2 характеризуется широким диапазоном температурной и рНустойчивости и высокой стабильностью при хранении. Штаммы й. ЛгороШ гидролизуют нитрилы по нитрилгидратазноамидазному пути метаболизма. Наиболее высокая амидазная активность выявлена у штамма й. Ш РЗ, трансформирующего акрилонитрил в акриловую кислоту без накопления промежуточного амида. Наиболее перспективным для получения эффективного биокатализатора синтеза акриловой кислоты является штамм Р. АиогеБсет С2, обладающий нитрилазной активностью. Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Региональной конференции Проблемы химии и экологии, Пермь, Всероссийской конференции Экология проблемы и пути решения, Пермь, , Международном семинаре Научнотехнический потенциал Западного Урала в конверсии военнопромышленного комплекса Пермь, Межрегиональной конференции молодых ученых Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии, Пермь, VIVIII Пущинской школеконференции Биология наука го века, II и III Международных конгрессах Биотехнология перспективы и пути развития, Москва, , . По теме диссертации опубликовано научных работ и получен патент на изобретение Российской Федерации. Объем и структура диссертации. Список литературы включает 9 наименований работ, в т. Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме Биохимические и генетические системы трансформации органических соединений у бактерий, перспективных для биотехнологий номер госрегистрации . Программы фундаментальных исследований Президиума РАН Научные основы сохранения биоразнообразия России и Программы ОБН РАН Фундаментальные основы управления биологическими ресурсами. Исследования поддержаны грантом РФФИ 1. ГХ газовая хроматография КОЕ колониеобразующие единицы МИК минимальная ингибирующая концентрация МПА мясопептонный агар ОП оптическая плотность ПЦР полимеразная цепная реакция ЬВ среда ЛуриаБертани, НГ нитрилгидратаза, СЕ субъединица.