Современные ПЦР-системы для индикации и идентификации микобактерий и диагностическая значимость полимеразной цепной реакции при туберкулезе крупного рогатого скота

• Автор: Борисова, Татьяна Анатольевна
• Шифр специальности: 03.00.07, 16.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 127 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение

1. Обзор литературы

1.1 Биохимическая структура микобактериальной клетки

1.2 Иммунитет при туберкулезе

1.3 Методы диагностики туберкулеза крупного рогатого скота

1.3.1 Эпизоотологические данные

1.3.2 Клинический метод

1.3.3 Аллергический метод

1.3.4 Патологоанатомический и гистологический методы

1.3.5 Бактериологический метод

1.3.6 Серологический метод
1.4 Иммуноферментный анализ
1.5 Геномная дактилоскопия
1.6 Сполиготипированис
1.7 Полимеразная цепная реакция
1.8 Полимеразная цепная реакция в диагностике туберкулеза
2. Материалы и методы исследований
.ф 2.1 Материалы
2.2 Методы исследования
3. Результаты собственных исследований
3.1 Оценка метода выделения ДНК и проведение полимеразной цепной реакции тестсистемой НПО Нарвак г.Москва
3.1.1 Оценка метода выделения ДНК и постановки полимеразной цепной реакции тестсистемой для выявления возбудителей туберкулеза .vi
и М.i МТВсош ООО ИнтерЛабСервис ЦНИИ
Эпидемиологии М3 РФ г.Москва
3.1.2 Оценка метода выделения ДНК и постановки полимеразной цепной реакции тестсистемой для обнаружения ДНК i i
vi Пол игу б НПФ Литех г.Москва
3.2 Оценка метода выделения ДНК набором реагентов для
обнаружения ДНК в сыворотке или плазме крови методом
полимеразной цепной реакции НПФ Литех г.Москва
3.2.1 Оценка метода подготовки генетического материала набором
реагентов для выделения ДНК из биопроб для анализа методом полимеразной цепной реакции ДНКэкспресс НПФ Литех г.Москва
3.2.2 Оценка метода подготовки генетического материала набором
Выделение ДНК на магнитном сорбенте
3.3 Анализ информативности и специфичности существующих и
разработанных праймеров
3.4 Динамика обнаружения вакцинного штамма М.vi в крови и
молоке крупного рогатого скота, иммунизированного данной вакциной
3.5 Эпизоотическая обстановка и результаты комплексного исследования на туберкулез крупного рогатого скота в хозяйствах Республики Татарстан.
4. Обсуждение результатов
5. Выводы
6. Практические предложения
7. Список литературы
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ТВЕ трисборатный буфер
ТАЕ трисацетатный буфер
ПЦР полимеразная цепная реакция
ПААГ полиакриламидный гель
МТБ микобактерии туберкулеза
бацилла i
ЭДТА этилендиаминтетрацитрат натрия
ГЦ гуанидина тиоционата
ТЬ туберкулез
РВЛ Республиканская ветеринарная лаборатория
ГУВ КМ РТ Главное Управление ветеринарии Кабинета Министров Республики Татарстан
РНГА реакция непрямой гемагглютинации
РДП реакция диффузной преципитации
ИФА иммуноферментный анализ
РСК реакция связывания комплемента ппд протеинпурифиеддериват
КАМ аллерген из атипичных микобактерий
РБТЛ реакция бластранформации лимфоцитов ппн показатель повреждения нейтрофилов
МФА метод флюоресцирующих антител
РА реакция агглютинации
РГ реакция гемолиза
полиморфная ГЦобогащенная повторяющаяся последовательность главный полиморфный тендемный повтор
прямы повторы
. ii i
I Ii
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота рРНК рибосомная рибонуклеиновая кислота
vi
ВКО внутренний контрольный образец
пко положительный контрольный образец
смесь трифосфатов
тРНК транспортная рибонуклеиновая кислота
БМРВЛ Бугурусланская межрайонная ветеринарная лаборатория I микобактериальные единицы повторяемых вставок.
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Для ПЦРанализа пригодны различные биологические материалы слизь, моча, мокрота, кровь, сыворотка, молоко, соскобы эпителиальных клеток, кусочки органов, гистологические препараты. ПЦР метод относится к прямым методам обнаружения возбудителя, позволяющий обнаружить до одной молекулы ДНК в исследуемой пробе, даже когда организм является нежизнеспособным. Результаты исследования можно получить в день проведения анализа. Цель и задачи исследования. Целыо работы явилось изучение эффективности отечественных тестсистем для выявления и идентификации ДНК микобактерий, при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота в неблагополучных и ранее неблагополучных по туберкулезу хозяйствах, определение роли и места ПЦРметода для выявления ДНК штамма М. ПЦР в ветеринарную практику. Определить пригодность полимеразной цепной реакции для прижизненной и посмертной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота с использованием существующих на сегодняшний день отечественных тестсистем с определением их чувствительности и специфичности. Отработать различные методы подготовки генетического материала для ПЦР и определить наиболее эффективный для использования при выделении ДНК . Разработать наиболее информативные и специфичные паймеры для ПЦР, проанализировать их эффективность по сравнению с существующими рекомендованными праймерами. Определить пригодность полимеразной цепной реакции для установления сроков выявления ДНК вакцинного штамма М. Проводить системное исследование биологического материала от животных, положительно реагирующих на внутрикожное введение туберкулина из благополучных и ранее неблагополучных хозяйств. Научная новизна. Установлено, что наиболее чувствительными отечественными тестсистемами являются тестсистема МТВсот, позволяющая обнаруживать ДНК М. НПО Нарвак, которая позволяет идентифицировать М. М.i. Впервые при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота для подготовки генетического материала применялся метод магнитного сорбента, который оказался наиболее эффективным при работе с пробами патматериала, молока, культур. При выделении ДНК из крови установлено, что наиболее эффективным является Набор обнаружения ДНК в сыворотке или плазме крови методом ПЦР. Установлено, что праймер, обеспечивающий синтез региона М. Впервые изучена динамика выявления вакцинного штамма М. ПЦР и установлено, что ДНК М. Полученные результаты регулярно представлялись в Главное Управление ветеринарии КМ РТ для использования в оперативной работе по профилактике туберкулеза крупного рогатого скота. Практическое значение. Для идентификации микобактерий целесообразно использовать тсстсистему НПО Нарвак. Для более эффективного выделения ДНК из патматериала, молока, полевых культур целесообразно использовать метод магнитного сорбента, из крови Набор реагентов для обнаружения ДНК в сыворотке или плазме крови. Использование ПЦРметода в ветеринарной службе РТ позволили сократить сроки диагностики и дифференциальной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота. Апробация работы. Генодиагностика инфекционных заболеваний Москва, октября г. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ. Внедрение. Результаты исследований широко используются в практике ветеринарной службы Республики Татарстан, в лабораторных исследованиях КГАВМ, включены в учебный процесс по специальности эпизоотология, микробиология, биохимия. На защиту выносятся 1. Сравнительная оценка ПЦРметода по сравнению с другими методами исследования, такими как аллергическая проба и бактериологический метод, а также возможность определения сроков выделения с молоком вакцинного штамма М. Использование полученных данных в ветеринарной службе Республики Татарстан. Диссертация изложена на 7 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материатов и методов исследования, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов, списка литературы, включающего
источника, из них иностранных авторов. Диссертация иллюстрирована 8 таблицами и рисунками.