Диагностика цитомегаловирусной инфекции у недоношенных новорожденных детей и оценка анти-ЦМВ активности новых мембраноактивных полианионных соединений in vitro

• Автор: Павлова, Мария Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 155 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Цнтомега лови рус человека структура и репликация

1.1. Структура и организация генома

1.2. Репликация цитомегаловируса

Глава 2. Врожденная цитомегаловирусная инфекция ЦМВИ

2.1. Эпидемиология заболевания

2.2. Современные аспекты патогенеза ЦМВИ у детей первого месяца жизни

2.3. Клиника ЦМВИ у детей первого месяца жизни

2.6. Исходы внутриутробной ЦМВИ

2.5. Методы лабораторной диагностики ЦМВИ

2.5.1. Выявление инфекционной активности ЦМВ культуральными методами
2.5.2. Обнаружение вирусных антигенов в клинических образцах. Метод антигенемин
2.5.3. Определение нуклеиновых кислот вируса методами молекулярной биологии
2.5.4. Изучение противовирусных антител серологическими методами
2.6. Лечение ЦМВИ у новорожденных детей
Глава 3. Противовирусные химиопрспаратм. применяемые при ЦМВИ. Поиск и изучение новых антиЦМВ агентов
3.1. Патентованные лекарственные препараты, применяемые при
лечении ЦМВИ
3.1.1. Нуклеозиды и нуклеотидные производные ингибиторы ЦМВИ
3.1.2. Ненуклеозидные ингибиторы ЦМВИ
3.2. Лекарственные препараты, находящиеся на стадии клинических
испытаний
3.1.1. Нуклеозидные ингибиторы ЦМВИ
3.1.2. Ненуклеозидные ингибиторы ЦМВИ
3.3. Поликарбоксилатные соединения как потенциальные ингибиторы ЦМВИ
3.4. Заключение по обзору литературы СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 4. Материалы и методы
Культура клеток
Определение инфекционной активности вируса
Пациенты
Исследуемый материал
Быстрый культуральный метод БКМ
Твердофазный иммуноферментный анализ тИФА
Авидность антител
Полимеразная цепная реакция ПР
Мембраноактивные полианионные соединения МПС
Определение цитотоксичности МПС
Определение антивирусной активности МПС
Определение продукции инфекцнонно активного вируса
Иммуноцитохимический метод выявления вирусспецифических белков
Изучение динамики накопления ЦМВ под действием веществ методом
ГТЦР в реальном времени
Внутриклеточная локализация МПС в диплоидных фибробласгах человека
Статистические методы анализа
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Глава 5. Выявление маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных с признаками ВУИ.
5.1. Частота обнаружения маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей
5.1.1 .Частота обнаружения прямых маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей. Выявление внутриутробной ЦМВИ
5.1.2. Частота обнаружения маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей методами серодиагностики
5.2. Изменение маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей в течение первого года жизни
Глава 6. Оценка антиЦМВ активности новых поликарбоксилатных соединений, модифицированных мембранотропными и аминосульфокнелотнымн фармакофорами
6.1. Цнтотоксичность МПС в культуре клеток
6.2. Противовирусная активность МПС i vi
6.2.1. Лечебное действие МПС
6.2.2. Профилактическое действие МГ1С
6.2.3. Вирулицидное действие МПС
6.2.4. Микробицидное действие МПС
6.2.5. Изменение продукции инфекционного вируса под действием МПС
6.3. Влияние МПС на проникновение ЦМВ в чувствительные
клетки
6.4. Влияние МПС на синтез вирусных белков в инфицированных клетках
6.5. Влияние МПС на динамику накопления ДНК ЦМВ в инфицированных клетках
6.6. Изучение внутриклеточной локализации МПС в диплоидных фибробластах человека
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


На примере одного из представилей мембраноактивных полианионных соединений показано, что он эффективно подавляет проникновение ЦМВ в чувствительные клетки, а также ингибирует накопление вирусной ДНК и экспрессию поздних структурных белков ЦМВ в зараженных клетках. Глава 1. ЦИТОМЕГАЛОВИРУС ЧЕЛОВЕКА СТРУКТУРА, ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА И РЕПЛИКАЦИЯ. Цитомегаловирус человека ЦМВ относится к семейству vii и является типичным представителем рода vi. Структура и организация генома. Структура вириона. Вирион ЦМВ состоит из капсида, в который заключен линейный геном вируса. Капсид окружает тегументный слой или матрикс аморфной формы 9, который в свою очередь, покрыт липопротеиновой оболочкой. Диаметр вириона составляет от 0 до 0 им 0,6. Геном ЦМВ представлен дезоксирибонуклеиновой кислотой ДНК размеры которой могут варьировать от 0 до 0 т. Капсид вириона имеет форму икосаэдра, каждая грань которого является равносторонним треугольником и построена из структурных субъединиц, уложенных с интервалом около 3 нм. Всего в состав нуклеокапсида входит 2 капсомера 7,0,1. Тегумент представляет собой фибриллярное, электронноплотное, часто неравномерно распределенное покрытие нуклеокапсида, состоящее из вирусных гликопротеинов 6,7,9. Наружная мембрана вируса, окружающая капсид и тегумент, является модифицированной цитоплазматической мембраной клетки хозяина, в которую включены вирусные гликопротеины ,4. Белки вириона. Известно, что в составе инфекционного вириона содержатся от до
белков, с молекулярной массой от до 0 кДа 0. В настоящее время не вес потенциально возможные белки вируса идентифицированы. Установлено, что вирусный капсид состоит из семи белков минорный капсидный белок тСР, мажорный капсидиый белок МСР, кодируемые участками генома и , соответственно, минорный капсид связывающий белок ВР, кодируемый , малый капсидный белок , кодируемый . В состав вирусной оболочки входят более десяти вирусных гликопротеинов, включающих , , X, , 0, I 0,. Белковые продукты шести гликопротенов ассоциированы в комплексы I, I III 5. Структура ДНК. ДНК ЦМВ состоит из двух ковалентно связанных компонентов длинного компонента и короткого компонента. Каждый компонент представляет уникальные последовательности и , фланкированные инвертированными повторами I ,I и I 2. Геном ЦМВ богат парами, которые, в основном, входят в состав прямых и инвертированных повторов. В геноме ЦМВ количество кластеров, образуемых этими повторами, значительно превышает таковые у других герпес вирусов 5. Полная нуклеотидная последовательность определена для лабораторного штамма ЦМВ 9 . Геном штамма 9 содержит 0 тысяч пар оснований и кодирует около 5 открытых рамок считывания ,9. Сравнение нуклеотидной последовательности штамма 9 с геномом других герпесвирусов обнаружило, что более чем кодируют консервативные белки, гомологичные белкам альфа и гамма герпесвирусов . Консервативные преимущественно локализованы в области ДНК ЦМВ . ДНК. Полипептиды, кодируемые остальными , участвуют в созревании и входят в состав вирнонов. В нас тоящее время идентифицированы продукты около ЦМВ 9. Репликация цитомегаловируса. Проникновение вируса в клетку. Проникновение вируса в клетку происходит в результате каскада взаимодействий между поверхностными белками вируса и рецепторами клетки. На первом этапе поверхностный гликопротеин В связывается с гетерополисахаридом клетки гепаринсульфатом, тем самым инициируя взаимодействие вируса с клеточной поверхностью 0. Для адгезии вирусной частицы на клеточной поверхности необходимо последующее взаимодействие с негепариновым рецептором Мм кДа 0. В процессе проникновения в клетку участвует также ЦМВ. Слияние вирусной оболочки с клеточной мембраной и последующее проникновение вируса в клетку происходят после взаимодействия гетероолигомерного III комплекса, состоящего из , с дополнительными клеточными рецепторами, которые в настоящее момент еще не идентифицированы 5,0. После проникновения вируса в цитоплазму идет быстрое перемещение пуклеокапсида, окруженного тегументом, в ядро клетки. В связи с этим, менсс чем через 1 час после проникновения вируса в клетку тегументный белок рр, в большом количестве имеющийся в вирионе, может быть обнаружен в ядре инфицированной клетки 0.