Изучение свойств химеры флавивирусов Лангат и Денге 4 как кандидата в живую вакцину против клещевого энцефалита

• Автор: Припузова, Наталья Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 172 с. : ил.

Введение

Обзор я итерлтуры

1. Осщля характеристика Рода vivi

. Химические и физические свойства флавивирусов.

1.2 Структура генам а флавивирусов.

1.3 Функционазьные характеристики белков

1.4 Проникновение вириона в клетку

1.5 Трансляция и протеолитический процессинг

1.6 Репликация РНК

1.7 Сборка и освобождение вирусных частиц из инфицированных клеток

1.8 Антигенная классификация

1.9 Роль структурных и неструктурных белов в иммунном ответе
2. Генетические маркеры вирулентности и тропизма флавивирусов.
2.1 Мутации в 5 и 3. влияющие на вирулентность и тропизм.
2.2 Мутации в поверхностном гликопротеине Е, влияющие на вирулентность, тропизм и связывание с моноклональными антителами.
2.3 Мутации, влияющие на вирулентность флавивирусов, в других структурных белках
2.4 Влияние на вирулентность флавивирусов мутаций в последовательности неструктурных баков
3. СПОСОБЫ ПРОФИЛАКТИКИ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА.
4. ИСТОРИЯ ПОЛУЧЕНИЯ И ИЗУЧЕНИЯ ВАРИАНТОВ ЖИВОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА.
5. НОВЕШИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ОБЛАСТИ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИВОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВКЭ
6. КРИТЕРИИ ОТБОРА И МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ПРЕДЛОЖЕННЫХ АТТЕНУИРОВАННЫХ ВАРИАНТОВ ЖИВЫХ ВАКЦИН ПРОТИВ ВКЭ.
6.1 Критерии безопасности.
6.2 Стабильность свойств и генетическая стабизьность
6.3 Оценка возможной персистенции аттенуированных вирусов.
6.4 Способы оценки эффективности вакцин.
Материалы и методы
1. Вирусы.
2. ЭКСПЕРИМЕНТЫ НА ОБЕЗЬЯНАХ
3. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ОБРАЗЦОВ ОРГАНОВ ОБЕЗЬЯН ДЛЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО И ВИРУСОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗОВ
4. ГИСТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЦНС.
5. ЭКСПЕРИМЕНТЫ НА МЫШАХ
6. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ОБРАЗЦОВ КРОВИ.
7. Определение виремин в сгустках крови обезьян с помощью титрования на мышах
8. Определение титров штамма Аьсегтаров ВКЭ в органах и в сыворотках или сгустках крови методом бляшек
9. Определение титров химеры ТР 4 методом бляшек
Ю. Активация персистентной инфекции у мышей.
. Проведение пассажей 2I4 ил V.
. выявление вирусной РНК в мозге мышей
. Секвенирование последовательностей РНК вирусов, полученных п результате пассажей химеры V.
. ИММУНОФЕРМЕНТИЫЙ АНАЛИЗ ИФА
. Реакция нейтрализации
. Иммунопреципитация вирусспецифических белков с использованием протеинАсефарозы
. Опыты с использованием клещей.
Результаты собственных исследований.
1. Оценка степени аттенуации химеры 2I4 в экспериментах на лабораторных
1.1. Сравнение степени вирулентности химеры 4 с высоковирулентным штаммам Абсеттаров ВКЭ и родительским штаммом ТР вируса Лангат
1.2 Разработка метода выявления вирусной РНК в мозге незаболевших мышей после i, Iс или i введения
1.3. Нейровирулентность химеры 4 в опытах по i
заражению сосунков. 4
1.4. Сравнение уровня репродукции химеры 4, вируса Лангат и штамма Абсеттаров
В КЗ при i введении лабораторным мышам линии В весам г.
1.5. Степень вирулентности и скорость распространения по ЦНС химеры 4 в сравнении с вирусами Лангат и КЗ при i введении мышам.
1.6. Периферическая вирулентность 4 на мышах.
1.7. Оценка возможности персистенции химеры в организме мышей В г после i.
i и i введений
2. ОПЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ ХИМЕРНОГО ВИРУСА 4 НА МОДЕЛИ ОБЕЗЬЯН
2.1 Периферическая вирулентность 4 в экспериментах на обезьянах по сравнению с высоко вирулентным штаммом Абсеттаров ВКЭ
2.2 Оценка остаточной нейровирулентности химеры 4 в экспериментах на зеленых мартышках i i при интрацеребральном введении
3. ОЦЕНКА СТАБИЛЬНОСТИ ВИРУСА 4 ПРИ ПАССАЖАХ НА КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК V И ЧЕРЕЗ МОЗГ ЛАБОРАТОРНЫХ МЫШЕЙ
3.1 Оценка стабильности химеры при пассажах на культуре клеток V.
3.2 Оценка стабильности химеры при пассажах через мозг лабораторных мышей.
4. ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ИММУНИЗАЦИИ ХИМЕРОЙ 4 ДЛЯ ЗАЩИТЫ ПРОТИВ ВИРУСОВ КОМПЛЕКСА ВКЭ В ОПЫТАХ НА ЛАБОРА ТОРНЫХ МЫШАХ
4.1. Оценка протективной эффективности и формирование иммунного ответа при различных схемах и способах иммунизации.
4.2. Длительность защиты против ВКЭ при i иммунизации химерой в сравнении с инактивированными вакцинами производства ФГУППИПВЭ 1 i I , Австрия
4.3. Протективная активность химеры 4 против других штаммов ВКЭ и вируса ОГЛ при i иммунизации в сравнении с инактивированной вакциной производства ИПВЭ.
5. ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ИММУНИЗАЦИИ ХИМЕРОЙ 4 ПРОТИВ ВКЭ В ОПЫТАХ НА ОБЕЗЬЯНАХ.
5.1. Оценка иммуногенности химеры при иммунизации
5.2. Оценка эффективности иммунизации химерой против разрешения ВКЭ.
5.3. Оценка эффективност и иммунизации химерой против i разрешения ВКЭ
6. ОЦЕНКА ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ ХИМЕРЫ 4 В ОПЫТАХ НА КЛЕЩАХ
6.1. Моделирование передачи вирусов КЗ и химеры 4 иксодовым клещам при питании па зараженных мышах.
6.2. Изучение фенотипических и генетических свойств вируса, выделенного из взрослой самки 1. при питании на мыши, зараженной химерой.
6.3. Изучение способности химеры 4 к репродукции в иксодовых клещах
Обсуждение
1. БЕЗОПАСНОСТЬ ХИМЕРЫ 4 НА МОДЕЛИ ЛАБОРАТОРНЫХ МЫШЕЙ И ОБЕЗЬЯН.
2. ОЦЕНКА ПРОТЕКТИВНОСТИ ХИМЕРЫ 4 НА МОДЕЛИ ЛАБОРАТОРНЫХ МЫШЕЙ И ОБЕЗЬЯН.
3. ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ И ФЕНОТИПИЧЕСКОЙ СТАБИЛЬНОСТИ СВОЙСТВ ХИМЕРЫ 4 ПРИ ПАССАЖАХ НА КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК V И ЧЕРЕЗ МОЗГ МЫШЕЙ.
4. ХАРАКТЕРИСТИКА МУТАЦИЙ, НАЙДЕННЫХ В ГЕНОМЕ ХИМЕРЫ 4, ПРИ ПАССАЖАХ НА КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК V И ЧЕРЕЗ МОЗГ МЫШЕЙ.
5. ОЦЕНКА ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ ХИМЕРЫ 4 В ОПЫТАХ НА КЛЕЩАХ
6. РАЗРАБОТКА КРИТЕРИЕВ ОЦЕНКИ АТТЕНУИРОВАННЫХ ШТАММОВ
КАНДИДАТОВ В ЖИВУЮ ВАКЦИНУ ПРОТИВ ВКЭ.
Выводы.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Трансляция происходит на мембране эндоплазматического ретикулюма . Во время трансляции некоторые части полипротсина транспонируются во внутреннее пространство люмен, тогда как другие остаются на цитошазматической стороне рисунок 1 i i, . Рисунок 1. Схема трансляции полипротеина флавивирусов i i, . После трансляции геномной мРНК репликация РНК начинается с синтеза комплиментарных негативных нитей, на которых затем синтезируются позитивные нити путем иол у консервативного механизма с привлечением репликативных интермедиатов i и репликативных форм . Позитивные нити могут быть использованы для трансляции структурных и неструктурных белков, синтеза негативных нитей или образования вирионов. Основываясь на данных о локализации двухни гевой РНК и изучении фракций инфицированных клеток можно сделать заключение, что синтез РНК. ЭР i i, . Улыраструктурные исследования показали, что морфогенез вириона происходит в . В транспорт нарождающихся вирионов из аппарата Гольджи к клеточной мембране, где происходит экзоцитоз, вовлечен везикулярный механизм транспорта клетки. Расщепление ргМ происходит непосредственно перед высвобождением зрелых вирионов. Функция ргМ в гетеродимерах заключается в защите белка Е от конформационных изменений во время продвижения незрелых вирусных частиц через внутриклеточные компартменты с более низким значением i а. После расщепления ргМ взаимодействие ргМ и Е дестабилизируется, происходит перестройка гетеродимеров в димеры белка Е. После этого белок Е приобретает фьюзогенную активность. Гемагглютинирующая активность флавивирусов, зависящая от низких , возможно, связана с фьюзогенной активностью белка Е. Все члены рода vivi имеют общие антигенные сайты. Поскольку белок Е является вирусным геммагглютинином и основной мишенью для нейтрализующих антител, данные по перекрестной нейтрализации и реакции торможения ГА отражают различия в антигенной структуре именно этого белка. На основе реакции перекрестной нейтрализации с использованием поликлональных гипериммунных антисывороток было показано присутствие у флавивирусов группо, серокомплекс и типоспецифических антигенных детерминант . Е субкомплскс, субтип, штаммовая и субштаммовая специфичности i . Эта классификация также связана с основными биологическими и эпидемиологическими характеристиками флавивирусов. Моноклональные антитела также открыли антигенные взаимоотношения на эпитопном уровне, которые объединяют различные антигенные комплексы рисунок 2. Было показано очень близкое антигенное родство флавивирусов, входящих в единый антигенный комплекс , . Комплекс КЭ включает антигенноблизкородственных вирусов, из которых вызывают заболевания человека , . Определенные в последние годы полные или частичные нуклеотидные последовательности большого числа флавивирусов позволили классифицировать их с помощью построения эволюционных деревьев. Сравнение аминокислотных последовательностей белка Е и других белков показало, что классификация по последовательностям совпадает с серокомплексами флавивирусов, определенными с использованием поликлональных иммунных сывороток . Рисунок 2. Корреляция между гомологии аминокислотных последовательностей белка Е флавивирусов и группированием флавивирусов в серокомплсксы с помощью поликлональных сывороток , . Комплекс клещевого энцефалита и вирус желтой лихорадки наиболее удалены друг от друга с гомологией последовательностей зависимой от пары сравниваемых вирусов. Несколько более тесные связи существуют между членами серокомплекса Японского энцефалита ЯЭ и Денге . Различные типы вируса Денге имеют сходства по аминокислотной последовательности i а. Внутри вирусов ЯЭ и ВКЭ уровень нуклеотидной гомологии как минимум и соответственно. Будучи главным компонентом поверхности вириона, белок Е играет доминирующую роль в генерации нейтрализующих антител и индукции иммунного ответа. Это показано путем активной иммунизации животных очищенными субвирионными компонентами, рекомбинантными белками, путем пассивной защиты с помощью поликлональной сыворотки и специфических моноклональных антител к белку Е .