Механизм трансляционной активации РНК потексвирусов

• Автор: Архипенко, Марина Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 109 с. : 16 ил.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

СТРОЕНИЕ ПЛАЗМОДЕСМ

ТРАНСПОРТ ВИРУСОВ В РАСТЕНИЯХ

Ближний транспорт

Дальний транспорт

ВИРУСЫ, КОДИРУЮЩИЕ ТРОЙНОЙ БЛОК

ГЕНОВ ТБГ

Организация генома вирусов семейства

ТиЬугсае

Организация генома вирусов семейства

Роехугсае
БЕЛКИ ТРОЙНОГО БЛОКА ГЕНОВ
БЕЛКИ ТБ 1
Структурная организация ТБ1
Биохимические свойства ТБ1
Функциональные свойства ТБ1
Внутриклеточная локалтзация
БЕЛКИ ТБ2 и ТБЗ
Структурная организация ТБ2 и ТБЗ
Внутриклеточная локализация ТБ2 и ТБЗ
Функциональные свойства
ТРАНСПОРТ ТГБ СОДЕРЖАЩИХ ВИРУСОВ
Роль белка оболочки в межклеточном транспорте
Транспортная форма потексвирусов
Предполагаемый механизм транспорта ТБГ
содержащих вирусов
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Заражение растений ХВК
Выделение препарата Хвируса картофеля
Обработка препаратов ХВК трипсином
Экспрессия рекомбинантных белков
Хроматографическая очистка Гис
рекомбинантных белков на М2гнитрилотриацетатной агарозе
Трансляция в бесклеточной белоксингезирующей системе ип экстракта зародышей пшеницы
Выделение белка оболочки ХВК
Электрофоретический анализ белков в
денатурирующем полиакриламидном геле
Иммуноблотанализ
Выделение препаратов различных фракций из
гомогената листьев . и .i
1. Получение препарата фракции клеточных стенок
2. Получение препарата растворимой цитоплазматической фракции
Фосфорилинование ш vi
Выделение РНК из вирусных препаратов ХВК
Электрофорез РНК в агарозном геле
Электрофорез РНК в ПААГ
Иммуноэлектронная микроскопия комплексов
ХВКТВ 1 ХВК
Атомносиловая микроскопия
Получение вРНП
РЕЗУЛЬТАТЫ
I. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТРАНСПОРТНОГО БЕЛКА
ТБ1 СВИРИОНАМИ ХВК ЯВЛЯЕТСЯ ОБРАТИМЫМ
И. ДЛЯ СВЯЗЫВАНИЯ ТБ1 СХВК НЕ НУЖНА
ИНТАКТНАЯ ВИРУСНАЯ РНК
1. Характеристика частиц ХВК,
обработанных смесью РНКаз ХВКдегрРНК и их
комплексов с ТБ 1.
2. Изучение методом атомносиловой
микроскопии разборки ХВК, индуцируемой
тлоилпгчпггтт т в
транспортным белком
III. ОСОБЕННОСТИ ТРАНСЛЯЦИОННОЙ
РАЗБОРКИ ХВК
1. Кинетика трансляционной активации РНК в составе комплекса ХВКТБ1 и фосфорилированного ХВК.
2. ТБ 1зависимая разборка ХВК на стадии инициации и начальных этапах транслокации трансляции.
3. Фракционирование в градиенте концентрации сахарозы комплексов ТБ IХВК и ХВКР, проинкубированных в ЭЗП
4. анализ 3концевой области РНК ХВК
IV. ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ ТРОЙНОГО
КОМПЛЕКСА РЕКОНСТРУИРОВАННОГО I VI ИЗ РНК, БЕЛКА ОБОЛОЧКИ И ТРАНСПОРТНОГО БЕЛКА ХВК
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ВЫВОДЫ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Названия вирусов
КА вирус комковатости арахиса
ВМБ вирус мозаики бамбука
ВМБК вирус мозаики белого клевера
ВМЛ вирус мозаики люцерны
ВМЛис вирус мозаики лисохвоста
ВМК вирус мозаики костра
ВМП вирус мозаики папай
ВМПА вирус мозаики подорожника азиатского
ВНПЖС вирус некротичсскогопожелтсния жилок свеклы
ВТМ вирус табачной мозаики
ВШМЯ вирус штриховатой мозаики ячменя
ВХККГ вирус некротической крапчатости коровьего
горошка
ВЮМФ вирус южной мозаики фасоли
ПЛВМ полулатентный вирус мятлика
ХВК Хвирус картофеля
V ii vi вирус ямчатости
древесины яблони i vi vi вирус
некротического пожелтения жилок свелы V i i vi вирус штриховатой
мозаики ячменя
V vi вирус комковатости арахиса
V vi вирус кустистости
верхушки картофеля V vi М Мвирус картофеля
VX vi X X вирус картофеля
VX vi X Хвирус шалота
Другие сокращения
атомюсиловая микроскопия
АТФ аденозинтрифосфат
ББС бесклеточная белоксинтезирующая система
БО белок оболочки
БСА бычий сывороточный альбумин
ВРНП вирусный рибонуклеопротеидный комплекс
ГТФ гуанозинтрифосфат
ДСН додецилсульфат натрия
ДТТ дитиотреитол
ИПТГ изопрогил1 тиогалактозид
ИЭМ иммуноэлектронная микроскопия
КК2 казеинкиназа
МЕТ метилтрансферазный домен
МН микрококковая нуклеаза
МЭ меркаптоэтанол
НТФ нуклеотидтрифосфат
ОРТ открытая рамка трансляции
ГТААГ полиакриламидный гель
ПКС протеинкиназа С
ППС предельная пропускная способность
ПЭГ полиэтиленгликоль
РНП рибонуклеопротеидный комплекс
ТБ транспортный белок
ТБГ тройной блок генов
ТЕМЕД ,,, тетраметилэти лен диамин
ХЕЛ хеликазный домен
ЦГ циклогексимид
ЭДТА этилендиаминтетраацетат натрия
ЭЗП экстракт зародышей пшеницы
ЭМ электронная микроскопия
зпкт электронноплотные кристаллические тельца
ЭПР эндоплазматический ретикулум
i xi ii
ВВЕДЕНИЕ


ТБ 1. III. Кинетика трансляционной активации РНК в составе комплекса ХВКТБ1 и фосфорилированного ХВК. ТБ 1зависимая разборка ХВК на стадии инициации и начальных этапах транслокации трансляции. IV. ВВЕДЕНИЕ. Транспорт вирусной инфекции в зараженном растении в настоящее время является одной из наиболее интенсивно изучаемых проблем современной фитовирусологии. Исследование молекулярных механизмов данного процесса, представляющего собой частный случай общей физиологической функции транспорта макромолекул в растениях, имеет не только важное теоретическое значение, но и обеспечивает фундаментальные основы для разработки эффективных методов борьбы с вирусными агентами. В момент заражения растения вирусом только небольшое количество клеток оказывается инфицированными. Для развития инфекции необходимо перемещение вируса от зараженных клеток к здоровым. Ранее считалось, что межклеточный транспорт вирусов процесс пассивный, теперь совершенно очевидно, что в нем играют важнейшую роль специфические вирусные транспортные белки ТБ. Они обеспечивают как внутриклеточный транспорт вирусного генома от места репликации к плазмодесмам, так и его межклеточный транспорт из зараженной клетки в соседние здоровые. Вирусная РНК перемещается из зараженной в здоровые клетки в составе нуклеопротеидной структуры, являющейся транспортной формой. Предполагается, что во время транспорта РНК исключается из процессов трансляции и репликации, а после проникновения в здоровую клетку становится доступной для рибосом и, соответственно, для продолжения развития инфекции. На примере транспортной формы ВТМ было показано, что РНК в комплексе с транспортным белком недоступна для рибосом, но фосфорилирование ТБ ВТМ делает трансляцию возможной. РНК ВТМ происходит в результате котрансляционного раздевания ВТМ рибосомами i , . Объектом нашего исследования являлся X вирус картофеля ХВК типичный представитель рода xvi, содержащий геномную одноцепочечную плюс РНК. Предложены две модели транспорта потсксвирусов из клетки в клетку через плазмодесми либо перемещение генома в составе вириона . Ранее в нашей лаборатории было показано, что РНК ХВК, в отличие от РНК ВТМ, не способна транслироваться i vi в составе вирусных частиц, но может быть трансляционно активирована двумя разными способами в результате фосфорилирования белка оболочки ХВК v . ТБ1.