Выявление и идентификация респираторных вирусов методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени

• Автор: Никонова, Александра Александровна
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 141 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Молекулярнобиологическая и эпидемиологическая характеристика респираторных вирусов.

1.1.1.РНКсодержащие вирусы.

1.1.1.1. Семейство ОпИотухоутае

1.1.1.2. Семейство Рагатухоушбае

1.1.1.3. Семейство РюогпауМае.

1.1.1.4. Семейство Согопаутбае

1.1.2. ДНКсодержащис вирусы.

1.1.2.1. Семейство АбепоуМае

1.1.2.2. Семейство НсгреБУЙас

1.1.2.3. Бокавирус человека.
1.2. Методы этиологической диагностики респираторных заболеваний
1.2.1. Выделение вируса в культуре чувствительных клеток.
1.2.2. Иммунологические методы выявления респираторных вирусов.
1.2.2.1. Реакции с использованием химических меток
1.2.2.2. Реакции, основанные на феномене агглютинации
эритроцитов.
1.2.2.3. Методы серологической диагностики
1.2.3. Методы амплификации нуклеиновых кислот
1.2.3.1. Полимеразная цепная реакция ПЦР
1.2.3.2. Мультиплексная ПЦР.
1.2.3.3. ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального
времени.
1.2.3.4. Мультиплексная ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме
реального времени.
1.2.3.5. Другие методы амплификации нуклеиновых кислот.
1.2.3.6. Тип образца и методы пробоподготовки
1.2.3.7. Выявление ингибиторов амплификации и
контроль контаминации
1.2.3.8. Клиническое применение методов амплификации нуклеиновых кислот.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы.
2.1.1. Лабораторные штаммы вирусов
2.1.2. Клеточные линии
2.1.3. Клинические образцы
2.1.4. Реактивы.
2.2. Методы
2.2.1. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей.
2.2.2. Методика получения мазков из полости носа для диагностики ОРВИ методом ПЦР
2.2.3. Выделение вирусных нуклеиновых кислот
2.2.4. Реакция обратной транскрипции
2.2.5. Полимеразная ценная реакция моноспецифический формат.
2.2.6. Полимеразная цепная реакция мультиплексный формат
2.2.7. Электрофорез ДИК в агарозном геле
2.2.8. Полимеразная цепная реакция с флуоресцентной детекцией в
режиме реального времени ТацМап.
2.2.9. Получение калибратора для количественного учета вирусной РНК в биологических образцах
2.2Сгатистическая обработка результатов исследований
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Подбор праймеров и оптимизация условий выявления ДНК аденовирусов
человека в биологических образцах методом ПЦР
3.2. Подбор праймеров и зондов, оптимизация условий для дифференциального выявления риновирусов и энтеровирусов в биологических образцах методом ПЦР
3.3. Выявление респираторных вирусов человека в биологических образцах методом мультиплексной ПЦР с детекцией продуктов амплификации в агарозном геле.
3.4. Разработка тестсистемы на основе мультиплексной ПЦР в режиме реального времени для выявления групп респираторных вирусов в биологических образцах.
3.4.1. Подбор праймеров и зондов, оптимизация условий мультиплексной ПЦРРВ
3.4.2. Сравнительный анализ эффективности и чувствительности мультиплексной и моноспсцифической ПЦРРВ.
3.4.3. Испытание тестсистемы на клинических образцах, полученных от больных с симптомами ОРВИ.
3.5. Количественное определение нуклеиновых кислот респираторных вирусов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
БЛАГОДАРНОСТИ
ПРИЛОЖЕНИЕ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Целью настоящего исследования являлась разработка мультиплексной ПЦРтестсистемы с детекцией в режиме реального времени, позволяющей одновременно выявлять в клинических образцах основных возбудителей респираторных вирусных инфекций человека вирусы гриппа А и В, вирусы парагриппа 1, 2, 3, 4 типов, аденовирусы, респираторносинцитиальный вирус, риновирусы и энтеровирусы. Научная новизна. Впервые в России разработана тсстсистема, позволяющая методом мультиплексной ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени выявлять в клинических образцах основных возбудителей респираторных вирусных инфекций человека, в частности, вирусы гриппа А и В, вирусы парагриппа 1, 2, 3, 4 типов, аденовирусы, респираторносинцитиальный вирус, риновирусы и эптеровирусы в присутствии внутреннего положительного контроля. Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов, используемые в тестсистеме, были разработаны в процессе выполнения данной работы, то есть являются оригинальными. Практическая значимость. В перспективе, с развитием методов специфического лечения респираторных вирусных заболеваний, подобные тестсистемы найдут применение в клинической практике для постановки диагноза и назначения адекватного лечения. Разработанные методические приемы для количественного учета нуклеиновых кислот респираторных вирусов могут быть использованы в научных исследованиях, в частности, для контроля уровня вирусной репродукции, наряду с традиционными методами титрования вирусов, при испытании противовирусных препаратов i vi и i viv. Основные положения, выносимые на защиту. В ходе выполнения работ, были подобраны нуклеотидные последовательности праймеров и зондов для выявления в биологических образцах вирусов гриппа А и В, вирусов парагриппа 1, 2, 3, 4 типов, аденовирусов, респираторносинцитиальный вируса, риновирусов и энтеровирусов и показана их специфичность на лабораторных штаммах респираторных вирусов. Разработана мультиплексная ПЦРтестсистема для одновременного выявления групп респираторных вирусов в клинических образцах. Анализ клинических образцов от больных с симптомами ОРВИ показал, что разработанная тестсистема не уступает по специфичности зарубежному аналогу. Разработан алгоритм для количественного учета нуклеиновых кислот респираторных вирусов, который был успешно применен в ряде научных исследований. Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Молекулярнобиологическая и эпидемиологическая характеристика респираторных вирусов. Семейство xvii. Классификация. Семейство xvii от греческого стандартный, правильный и туха слизь включает оболочечные вирусы с сегментированным одноцепочечным РНКгеномом негативной полярности и представлено 4 родами вирусы гриппа А, В, С и тоготовирусы иногда называемые вирусом гриппа . Вирусы гриппа А, В и С разделяются на основе антигенных различий между их нуклеопротеинами и матриксными М белками 3, 8. Только вирусы гриппа А и В являются причиной масштабных эпидемий и вызывают тяжелые заболевания. Вирус гриппа С является причиной спорадических заболеваний, чаще у детей. Он не вызывает эпидемий и не приводит к серьезным последствиям. Клиническая картина такая же, как при легких и умеренно тяжелых формах гриппа А 5, 8. На поверхности вириона вирусы гриппа А и В несут 2 гликопротсиновых антигена гемагглютинин ПА и нейраминидазу , которые обеспечивают основу для классификации вируса финна А на субтипы. На сегодняшний день известно типов НА и 9 типов . У вируса фиппа В есть только один тип НА и . Функция НА заключается в прикреплении вируса к рецепторам на поверхности клеток и проникновении в клетку, участвует в освобождении вновь сформированных вирусных частиц с поверхности зараженных клеток. Поверхностные гликопротеины вируса фиппа А демонстрируют более высокий уровень изменчивости, но сравнению с поверхностными гликопротсинами вируса фиппа В. Вирус фиппа С обладает только одним многофункциональным гликопротеином гемагглютининэстераза или белок слияния 8, 9. Другие важные характеристики, по которым различаются вирусы фиппа А, В и С, заключаются в следующем. Вирусы гриппа А, помимо людей, поражают широкое разнообразие видов птиц, а также свиней и лошадей. Вирус фиппа В поражает только людей.