Лейкоз крупного рогатого скота : Разработка методов лабораторной диагностики и средств специфической профилактики

• Автор: Мальцева, Надежда Анатольевна
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Новочеркасск
• Количество страниц: 197 с. : ил

ВВЕДЕНИЕ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ ДАННЫЕ О ВОЗБУДИТЕЛЕ ЛКРС

1.1. Краткие эпизоотологические сведения

1.2. Структурная организация ВЛКРС

1.3. Патогонез ЛКРС

1.4. Культивирование ВЛКРС

1.5. Лабораторная диагностика лейкоза крупного

рогатого скота

1.5.1. Гсматологический метод

1.5.2. Серологическая диагностика ЛКРС
1.5.2.1. Реакция иммунодиффузии в агаровом геле
1.5.2.2. Реакция связывания комплемента
1.5.2.3. Иммуноферментный анализ
1.5.2.4. Иммунный блотинг
1.5.2.5. Реакция иммунофлюореспенции
1.5.2.6. Радиоиммунологический анализ
1.5.3. Молекулярнобиологические методы диагностики ЛКРС
1.5.4. Вирусологические методы обнаружения ВЛКРС
ГЛАВА 2. СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА ЛКРС
2.1. Изучение возможности специфической иммунопрофилактики лейкоза крупного рогатого скота
2.1.1. Инактивированные цельновирионные вакцины
2.1.2. Субъединичные вакцины
2.1.3. ДНКвакцины на основе вируса осповакцины
2.1.4. Живые аттенуированные вакцины
Заключение
ЧАСТЬ II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Материалы
3.1.1. Среды
3.1.2. Сыворотки крови
3.1.3. Вирус
3.1.4. Животные
3.1.5. Культуры клеток и тканей
3.1.5.1. РЬКуч
3.1.5.2. ПТ
3.1.5.3. Краткосрочные культуры лейкоцитов
3.2. Методы
3.2.1. Вирусологические методы исследования
3.2.1.1. Концентрирование и очистка ВЛКРС
3.2.1.2. Приготовление антигена ВЛКРС
3.2.1.3. Определение плотностных характеристик ВЛКРС
3.2.1.4. Инактивация вируса
3.2.1.5. Сорбция вируса
3.2.2. Серологические реакции
3.2.2.1. Реакция иммунодиффузии в геле
3.2.2.2. Реакция связывания комплемента
3.2.2.3. Иммуноферментный анализ
3.2.2.4. Иммунный блотинг
3.2.2.5. Получение кроличьих антисывороток к ВЛКРС
3.2.3. Молекулярнобиологические методы
3.2.3.1. Определение обратнотранскриптазной активности
3.2.3.2. Выделение ДНК из лейкоцитов крови животных
3.2.3.3. Выделение ДНК из цельной крови животных
3.2.3.4. Радиоактивная обработка ДНКзонда
3.2.3.5. Молекулярная гибридизация
3.2.3.6. Полимеразная цепная реакция
3.2.4. Биохимические методы
3.2.4.1. Получение очищенных белков ВЛКРС
3.2.4.2. Электрофорез в ДСНполиакриламидном геле
3.2.4.3. Определение концентрации белка в растворах
ГЛАВА 4. ЭПИЗООТИЧЕСКИЕ ДАННЫЕ ПО ЛКРС
Заключение
ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА НОВЫХ МЕТОДОВ
КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВЛКРС
5.1. Разработка новой среды для культивирования культуры
клеток РЬКУ
5.2. Способ культивирования ВЛКРС в переживающих культурах
тканей
5.2.1. Культивирование ВЛКРС в переживающих культурах
тканей, зараженных вирусом из культуры клеток БЬКу
5.2.2. Культивирование ВЛКРС в переживающих культурах
тканей, зараженных вируссодержащими лейкоцитами
5.2.3. Исследование способности ВЛКРС пассироваться в переживающих культурах тканей
Заключение
ГЛАВА 6. РАЗРАБОТКА, ПОЛУЧЕНИЕ И ИСПЫТАНИЕ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ЛКРС 9I
6.1. Диагностический препарат ВЛКРС для РИД
6.1.1. Приготовление антигена для РИД с ПЭГ
6.1.2. Использование ядерных фильтров для
приготовления антигена ВЛКРС
6.2. Диагностический препарат ВЛКРС для И ФА
6.2.1. Приготовление вирусного антигена
6.2.2. Приготовление конъюгата
6.2.3. Определение иммунологической активности
вируса в препарате
6.2.3.1. Детекция антигена по непрямой схеме
6.2.3.2. Конкурентный метод детекции антигена
6.2.4. Проведение иммуноферментного определения
антител к ВЛКРС
6.2.4.1. Сенсибилизация пластин для проведения иммуноферментного определения
6.2.4.2. Подготовка образцов
6.2.5. Определение разведения конъюгата
6.2.6. Проведение ИФанализа
6.2.7. Оценка результатов
6.2.8. Полевые испытания препарата ИФдиагиостики
Заключение
ГЛАВА 7. РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Заключение НО
ГЛАВА 8. ИЗУЧЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ МОЛЕКУЛЯРНОБИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ВЛКРСИНФЕКЦИИ
8.1. Разработка и испытание метода молекулярной гибридизации для диагностики ВЛКРСинфекции с использованием
меченного ДНКзонда
8.2. Создание и испытание тестсистемы ПЦР диагностики ВЛКРСинфекции
8.2.1. Полевые испытания тестсистемы ПЦРдиагностики ЛКРС
8.2.2. ПЦРдиагностика экспериментальной ВЛКРСинфекции
у овец
8.2.3. Изучение возможности внутриутробной передачи ВЛКРСинфекции при использовании ПЦР
Заключение
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


В основу настоящей диссертационной работы положены материалы, полученные в результате выполнения научноисследовательской программы лабораторий лейкоза, вирусологии, биотехнологии СевероКавказского зонального научноисследовательского института по тематике Государственного Комитета по науке и технике СССР 0 Разработать методы и средства борьбы с лейкозами человека, сельскохозяйственных животных и птиц, 0 Разработать новые направления исследований генетического аппарата, основных биополимеров и структур клетки и внедрить достижения физикохимической биологии в народное хозяйство, а также по программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации на г. Разработать молекулярнобиологические основы совершенствования и создания новых высокоэффективных и экологически безопасных методов, средств, технологий и систем диагностики, профилактики и терапии болезней животных, обеспечивающих устойчивое ветеринарное благополучие и получение продукции животноводства высокого санитарного качества. Отдельные фрагменты работы выполнены совместно и на базах научноисследовательских учреждений Института вирусологии им. Д.И. РАМН рук. М.И. Парфанович , Белорусского научноисследовательского института эпидемиологии и микробиологии М3 РБ рук. В.Ф. Еремин, Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина рук. В . П. Карелин, ег. А.С. Каледин, Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН ст. Г.О. Шайхаев, Донского государственного аграрного университета рук. А.Г. Ропасв, Эстонской сельхозакадемии рук. Ю.А. Л.А. Животов, Шахтинской ветеринарной лаборатории директор Ю. В.Назаров. Я им всем приношу искреннюю благодарность. Целью исследований являлись изучение эпизоотической ситуации в регионе, разработка и усовершенствование методов лабораторной диагностики и средств специфической профилактики ЛКРС с дальнейшим их испытанием в полевых условиях. В процессе проведения диагностических исследований проведен анализ эпизоотической ситуации но ЛКРС в Ростовской области. РЬКу, путем замены сыворотки крови эмбриона коровы сывороткой крови северных оленей с целью снижения стоимости вирусных препаратов и изучены свойства полученного вируса. Впервые показана способность ВЛКРС репродуцироваться в переживающих тканях эмбрионов и молодняка КРС, овец и свиней. Изучены свойства вируса, показана способность его к последующему пассированию в тех же тканях. Разработан способ изготовления антигена ВЛКРС из вируса, накопленного в переживающих культурах тканей, для использования его в РИД и в ИФА. В опытах показаны специфичность и антигенная активность вновь полученного вирусного препарата в сравнении с ВЛКРС из РЪКу. Впервые показана способность инактивированного ВЛКРС, накопленного в эксплантатах переживающих культур тканей, вызывать у телят иммунный ответ, обеспечивающий устойчивость к последующему заражению вирулентным вирусом. Разработан и испытан молекулярнобиологический метод обнаружения ДНКпровируса ВЛКРС в лейкоцитах крови с помощью молекулярной гибридизации при использовании меченного ДНКзонда, в опытах показаны его специфичность и более высокая чувствительность в сравнении с серологическими методами. Сконструирована и испытана тестсистема диагностики ЛКРС с помощью полимеразной цепной реакции, в опытах показаны ее специфичность и более высокая чувствительность относительно серологических методов. Способ изготовления и контроля вакцины защищен авторским свидетельством. Внедрение разработанного метода ЦРдиагностики болезни позволит значительно снизить затраты на диагностические мероприятия вследствие использования в тестсистеме синтетических соединений, а также ввиду более высокой чувствительности метода относительно серологических, повысить эффективность оздоровительных мероприятий. Тестсистема ГЩРдиагностики одобрена и рекомендована к проведению широких полевых испытаний межведомственной комиссией Департамента ветеринарии МСХ и РФ акт испытаний прилагается. Диагностический набор ПЦРV представлен к испытаниям впервые в РФ. Учитывая, что стоимость сыворотки эмбриона коровы составляет 0 у. Ну i, I, i, США, стоимость получаемых биопрепаратов при культивировании вируса в бсссывороточной среде роста значительно снижается.