Разработка диагностических тест-систем для инфекционной бурсальной болезни на основе иммуноферментного анализа

• Автор: Оковытая, Татьяна Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Владимир
• Количество страниц: 127 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВЕДЕНИЕ.

1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общие сведения об инфекционной бурсальной болезни

1.2. Диагностика инфекционной бурсальной болезни.

1.3. Иммуноферментный анализ в диагностике ИББ.

1.3.1. Непрямой вариант ИФА

1.3.2. Сэндвичвариант.

1.4 Заключение по обзору литературы

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы и методы

2.2. Результаты исследований.
2.2.1. Разработка непрямого ИФА.
2.2.1.1. Подготовка антигена и иммобилизация его на планшеты
2.1.2.2 Определение оптимального времени экспозиции исследуемых сывороток.
2.2.1.3. Выбор величины разведения сыворотки, позволяющей наиболее корректно прогнозировать оценку титра антител
2.2.1.4. Определение диапазона значений показателей опти ческой плотности для отрицательного и положительного контролей
2.2.1.5. Определение значений 8Рпоказателей для разграничения неспецифической, сомнительной и специфической реакций.
2.2.1.6. Определение ожидаемого диапазона вариации показателей титров
2.2.1.7. Основные условия использования предлагаемой тестсистемы на основе непрямого варианта ИФА.
2.2.1.8. Сравнение оценок титров сывортки, установленных
в РДП и в предлагаемой тестсистеме.
2.2.1.9. Разработка способа перерасчета оценок титра, установленных с помощью предлагаемой тестсистемы и
коммерческого набора фирмы
2.2.2. Практическое использование разработанной тестсистемы на основе непрямого варианта ИФА
2.2.2.1. Исследование титров материнских антител, соответственно возрасту цыплят
2.2.2.2. Изучение динамики роста титра антител в начальные сроки после иммунизации живой вакциной
2.2.2.3. Изучение динамики роста и сохранение титра антител у птицы после иммунизации инактивированной вакциной
2.2.2.4. Использование разработанной тестсистемы
в плановых диагностических исследованиях проводимых во
ВНИИЗЖ
2.2.3. Разработка сэндвичварианта ИФА
2.2.3.1. Установление оптимальной концентрации конъюгата.
2.2.3.2. Определение оптимального соотношения концентраций улавливающих и детекторных антител.
2.2.3.3. Оптимизация условий иммобилизации улавливающих антител
2.2.3.4 Определение оптимального времени экспозиции исследуемого антигенена и детекторной сыворотки.
2.2.3.5. Титрование антигена.
2.2.3.6. Основные условия использования предлагаемой тестсистемы сэндвичварианта ИФА.
2.2.3.7. Сравнение титров антигена, установленных в РДП
и в предлагаемой тестсистеме.
2.2.3.8. Сравнение величин титров вирусного антигена и инфекционного вируса
2.2.4. Практическое использование разработанного сэндвичварианта ИФА
2.2.4.1. Определение титра антигена вируса ИББ в тканях бурсы и селезенки цыплят, иммунизированных живой вакциной
2.2.4.2. Оценка концентрации антигена в сырье для инактивированных вакцин.
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.
4. ВЫВОДЫ
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
7. ПРИЛОЖЕНИЯ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Большинство методов, позволяющих контролировать уровень антител к вирусу ИББ в сыворотках крови кур, а также присутствие вируса или его антигена в биологических материалах, основано на имуноферментном анализе ИФА , , , 1, 3, 6, 9, 5. Для выявления антител и определения их концентрации в сыворотках крови получил распространение непрямой вариант ИФА, в котором исследуемый образец взаимодействует с антигеном, иммобилизованным на планшете, далее антитела, в составе иммунных комплексов реагируют с конъюгатом. В свою очередь, для обнаружения и оценки титра антигена в биологических материалах широко применяют так называемый непрямой сэндвичвариант, где исследуемый антиген вначале улавливается специфическими антителами, иммобилизованными на планшете, а затем выявляется детекторными антителами, с которыми взаимодействует конъюгат . На основе ИФА разработаны и описаны различные тестсистемы , , , , 9, 8, 0, 4, 0, 4 или выпускаются готовые коммерческие диагностические наборы с прилагаемыми инструкциями , , . Важно отметить, что в литературе не обнаружено публикаций, в которых дано описание подготовки используемых компонентов, выбора их концентраций, условий проведения анализа и обоснования количественных показателей реакции. Учитывая очевидную перспективность методов ИФА, создание отечественных тестсистем для выявления и оценки концентрации антител к вирусу ИББ в сыворотках крови птиц и соответствующего антигена в биологических материалах является, безусловно, актуальным. Цели и задачи исследований. Главной целью исследований была разработка тестсистем на основе ИФА для выявления и определения титров антител к вирусу ИББ в сыворотках крови кур непрямой вариант, а также для обнаружения и оценки титра антигена вируса ИББ в биологических материалах сэндвичвариант. ИББ. ИББ. Научная новизна. Впервые разработаны отечественные тестсистемы на основе непрямого варианта ИФА для выявления и оценки концентрации антител к вирусу ИББ при тестировании сывороток в одном разведении. При этом отработаны методы получения антигена вируса ИББ, пригодного для ИФА, с последующей иммобилизацией его на планшет, определены оптимальные концентрации компонентов реакции и условия их взаимодействия, а также установлены пороговые показатели, разграничивающие специфическую и неспецифическую реакции, разработан способ опосредованного расчета титра антител при титровании проб в одном разведении. Сопоставлены результаты непрямого варианта ИФА и РДП и установлена корреляция между титрами, полученными этими методами, а также проведена оценка относительной чувствительности этих тестов. С помощью разработанной тестсистемы проведено изучение напряженности материнского иммунитета у цыплят, а также поствакцинального иммунного ответа у птиц после применения живых и инактивированной вакцин против ИББ. Проведено сопоставление титров антигена, установленных в ИФА с титрами, полученными в РДП и титрами инфекционного вируса, определена корреляция между показателями, полученными этими методами, и показана относительная чувствительность тестов. Проведено определение содержания антигена в органах птиц и в вирусном сырье, используемом для производства инактивированных вакцин против ИББ. Практическое значение работы. Полученные результаты научных исследований легли в основу 9 нормативных документов, методик, инструкций, указаний и рекомендаций по диагностике ИББ, которые одобрены ученым советом ВНИИЗЖ, утверждены директором института или Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России. Тестсистема, разработанная на основе непрямого варианта ИФА с субстратами ОФД и АБТС, в качестве официально зарегистрированных коммерческих диагностических наборов применяется для диагностики ИББ в различных регионах России и странах ближнего зарубежья. Во ВНИИЗЖ диагностические наборы в период с до г. Российской Федерации и ближнего зарубежья. Было реализовано указанных диагностических наборов, при этом стоимость одного исследования, выполненного с помощью разработанных наборов примерно в 4 раза дешевле, чем с использованием импортных. Тест система на основе непрямого сэндвич варианта ИФА применяется для оценки концентрации антигена в сырье, используемом для производства инактивированных вакцин против ИББ. ИФА.