Эпитопное картирование поверхностного гликопротеина Е2 вируса классической чумы свиней

• Автор: Костина, Людмила Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 139 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Классическая чума свиней

1.1.1 Распространенность и экономический ущерб.

1.1.2 Эпизоотологические данные

1.1.3 Патогенез и течение заболевания

1.2 Вирус КЧС.

1.2.1 Современная классификация вируса.

1.2.2 Антигенные свойства
1.2.3 Организация генома вируса КЧС и свойства кодируемых белков
1.3 Методы картирования антигенных детерминант
1.4 Гликопротеин Е2 вируса КЧС
1.4.1 Антигенная структура.
1.4.2 Эпитопное картирование белка Е2 вируса КЧС.
1.5 Иммунный ответ при КЧС
1.6 Лабораторная диагностика.
1.6.1 Средства и методы дифференциальной лабораторной диагностики КЧС.
1.6.2 МКА в лабораторной диагностике КЧС.
1.7 Специфическая профилактика и методы борьбы с КЧС
1.7.1 Стратегии контроля за заболеванием.
1.7.2 Маркированные вакцины
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Материалы.
2.1.1 Вирусы и клетки
2.1.2 Синтетические пептиды
2.1.3 Антигены.
2.1.4 Животные
2.2 Методы.
2.2.1 Иммуннизация
2.2.2 Миеломная клеточная линия.
2.2.3 Культивирование клеток
2.2.4 Слияние клеток и выращивание гибридом.
2.2.5 Криоконсервация гибридом
2.2.6 Получение асцитных жидкостей, содержащих МКА
2.2.7 Получение МКА из асцитных жидкостей.
2.2.8 Определение концентрации белка
2.2.9 Синтез иммунопероксидазных конъюгатов.
2.2. Субтипирование МКА.
2.2. Получение препаративного количества очищенного вируса КЧС
2.2. Приготовление осветленных лизатов культуральных антигенов
2.2. Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия ПААГДСН
2.2. Иммуноблоттинг.
2.2. Методы тврдофазного иммуноферментного анализа ИФА
2.21 Прямой метод ИФА.
2.22 Непрямой метод ИФА.
2.23 Непрямой метод ИФА с синтетическими пептидами
2.24 Конкурентный ИФА.
2.25 Сэндвичвариант ИФА
2.2. Иммуногистохимический анализ ИГХ.
2.2. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей белка Е2.
2.2. Статистическая обработка результатов.
3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1 Получение МКА к гликопротеину Е2 вируса КЧС
3.2 Иммунохнмическая характеристика МКА
3.3 Определение способности МКА выявлять нативные антигены вируса КЧС в сэндвичварианте ИФА
3.4 Топографическое картирование эпитопов на белке Е2 вируса КЧС с помощью конкурентного ИФА.
3.5 Определение способности полученных МКА конкурировать с поликлональными антителами к вирусу КЧС за связывание с эпитопами на белке Е2
3.6 Картирование антигенных детерминант белка Е2 вируса КЧС с помощью синтетических пептидов
4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


КЧС с иммунной системой хозяина, а также для разработки и усовершенствования диагностических тестсистсм. Выявление более тонких антигенных различий и эпитопное картирование структурных белков возможно только с помощью моноклональных антител МКА. Цель и задачи исследовании. Целью данной работы явилось получение и иммунохимическая характеристика панели моноклональных антител, специфичных к белку Е2 вируса КЧС, и изучение тонкой антигенной структуры данного белка путем картирования антигенных детерминант с помощью полученных моноклональных антител. Получить гибридомные клеточные линии, стабильно продуцирующие моноклональные антитела к гликопротеину Е2 вируса классической чумы свиней. Определить иммунологическую активность, специфичность и иммунохимические свойства полученных моноклональных антител. Оценить возможность использования полученных моноклональных антител для обнаружения антигенов вируса КЧС методом сэндвичвариапта ИФА. Определить оптимальные концентрации и условия взаимодействия моноклональных антител с антигеном Е2 вируса КЧС. Провести топографическое картирование эпитопов белка Е2, распознаваемых полученными МКА, с помощью конкурентного ИФА. Определить способность полученных моноклональных антител конкурировать с поликлональными антителами к вирусу КЧС за связывание с эпитопами на белке Е2. Оценить возможность использования полученных моноклональных антител для выявления антител к вирусу КЧС в сыворотках крови свиней методом конкурентного ИФА. Научная новизна и практическая значимость. Получена панель, состоящая из моноклональных антител, специфичных к белку Е2 вируса КЧС. На основе сэндвичварианта ИФА разработан лабораторный метод для обнаружения вируса КЧС. Установлена локализация и охарактеризовано 5 линейных Вклеточных эпитопов белка Е2 вируса КЧС, не описанных ранее. Антигенная детерминанта 46 а. Основные положения, выносимые на защиту. Моноклональные антитела, полученные в ходе работы, специфичны к белку Е2 вируса КЧС и активно взаимодействуют с данным белком в различных иммунохимических реакциях. Показана способность моноклональных антител выявлять природный белок Е2 в составе вириона вируса КЧС и конкурировать с антителами специфических сывороток крови за связывание с антигенными детерминантами белка Е2 вируса КЧС. КЧС на основе сэндвичварианта ИФА, в котором в качестве специфических реагентов были использованы моноклональные антитела к нативному вирусу КЧС. Установлено, что белок Е2 включает, по крайней мере, 8 иммуногенных эпитопов, из которых 5 являются линейными. Классическая чума свиней. Классическая чума свиней лат. англ. , i i v особо опасное инфекционное заболевание домашних свиней и диких кабанов 0, которое характеризуется высокой контагиозностыо и летальностью . Распространенность и экономический ущерб. КЧС была впервые описана в году в США штат Огайо. С тех пор эпизоотии данного заболевания распространились во всех странах мира. В Россию КЧС занесли предположительно в году, и с тех пор ее постоянно регистрируют 6. В странах ЕС за лет с по гг. КЧС, однако, с по гг. Резкое уменьшение случаев возникновения болезни обусловлено массовой вакцинацией свиней вакцина К в неблагополучных и угрожаемых зонах . В период гг. КЧС. После введения строгих мероприятий по контролю за заболеванием его успешно искоренили в Канаде г. США г. Австралия, Новая Зеландия и некоторые государства Евросоюза также до настоящего времени благополучны по КЧС. Тем не менее, вирус КЧС циркулирует в популяции свиней в Азии, Латинской Америке, Восточной Европе и на территории Российской Федерации . Глобальная ситуация по КЧС за несколько последних лет освещена рядом авторов , 1. В Азии количество вспышек зарегистрированных в году на превысило показатель года, а в Южной Африке, которая с года была свободна от КЧС, вновь регистрируют очаги данного заболевания . На значительной территории Восточной Европы установлено 3 сформировавшихся стационарных очага КЧС на Северном Кавказе и Нижнем Поволжье, в Восточной Сибири и на Дальнем Востоке .