Структурные и функциональные свойства цитокинин-связывающих белков растений Arabidopsis thaliana L., Hordeum vulgare L., Oryza sativa L.

• Автор: Прокопцева, Ольга Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 106 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ .

ЦЕЛЬ РАБОТЫ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

ПУБЛИКАЦИИ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Современные представления о роли группы гормонов цитокининов в жизнедеятельности растений
1.2. Современные представления о передаче сигнала цитокининов с помощью мембранного рецептора. Участие двухкомпонентной системы в восприятии и передаче цитокинииового сигнала

1.3. Регуляция транскрипции цитокинином генов АЯЯ

1.4. Другие возможные пути траисдукции цитокинииового сигнала. Существование для стероидных гормонов животных двух рецепторов мембранного и ядерного растворимого, а также научные факты, указывающие на существование растворимого рецептора цитокинина.
1.5. Свойства ЦСБ как возможного кандидата на растворимый рецептор к цитокинину.
1.6. Влияние ферментов метаболизма цитокининов синтеза, распада и модификации на ответ клеток на гормон. Возможная роль ферментов АДК и тиаминаз в метаболизме цитокининов и жизнедеятельности растительной клегки
1.7. ЦСБ их изучение, выделение и функции.
1.8. Гормонсвязывающие глютатионтрансферазы и их роль в растении
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
2.1. Объекты исследований
2.2. Синтез аффинных матриц
2.2.1. Синтез глютатионсефарозы
2.2.2. Синтез зеатинрибозидсефарозы
2.3. Синтез белоксодержащей аффинной матрицы АТтзсефарозы для выделения АТа.ТЗ
2.4. Синтез конъюгатов трансзеатина с белком
2.5. Получение АТа.н.
2.5.1. Получение иммунной сыворотки против зсатиирибозида .
2.5.2. Определение специфичности антисыворотки против зеатинрибозида и очищенных АТп
2.5.3. Выделение АТуз.
2.5.4. Получение АТа.иТЗ
2.5.5. Выделение АТа.ТЗ с помощью хроматографии на АТп
сефарозс
2.5.6. Выявление присутствия АТа.ТЗ в системе твердофазного
ИФА с иммобилизованными АТТз.
2.6. Выделение ЦСБ
2.6.1. Выделение из листьев v . и ii i . растворимой цитозольной фракции белков.
2.6.2. Гельфильтрация цитозольной растворимой фракции на
сефадексе .
2.6.3. Гидрофобная хроматография на фенилссфарозе
2.6.4. Аффинная хромато1рафия белков на зеатинрибозидссфарозе.
2.6.5. Выделение ядер.
2.6.6. Очистка ядерного ЦСБ с помощью глютатионсефарозы и зеатинрибозидсефарозы
2.6.7. Очистка АСБ по методу А.М. Джонса, с использованием сефарозы
2.6.8. Очистка АСБ по методу А.М. Джонса, с использованием глютатионсефарозы
2.6.9. Идентификация ЦСБ методом твердофазного ИФА
2.6 Очистка новых ЦСБ с помощью аффинной хроматографии на фенилсефарозе и зеатинрибозидсефарозе и элюции гормоном. Изучение сродства белка АДК к различным гормонам и лигандам.
2.6 Определение концентрации белка.
2.7. Электрофорез белков в ДДСI белков
2.8. Электропсренос белков
2.9. Иммупоблотинг
2 Окрашивание электрофоретических гелей серебром
2 Реакция транскрипции i vi.
2 Определение глютатионтрапсферазной активности ЦСБ
2 Определение количества сульфгидрильных групп с реактивом Эллмана.
2 Подготовка препаратов для масс спектрометрии
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Взаимодействие ЦСБ с антителами к консервативной последовательности гистидинкиназ
3.2. Изучение сходства цитокининсвязывающсго белка ЦСБ и ауксиисвязывающего белка АСБ Джонса
3.3. Изучение активации транскрипции i vi ЦСБ.
3.4. Поиск и идентификация ЦСБ ii i . и iv
3.5. Вытеснение АДК с зеатинрибозидссфарозы различными производными цитокининов и гомологичными им молекулами
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ПРИЛОЖЕНИЕ
ПУБЛИКАЦИИ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ii
АБК абсцизовая кислота
ЛДК аденозигкиназа
АСБ ауксинсвязывающий белок
АТаи антиидиотипические антитела
АТа.ИУК антиидиотипические антитела к ИУК
АТа.иТЗ антиидиотипические антитела к трансзеатину
ЛТпсптАСБ антитела к пептиду АСБ VV
АТтз антитела, специфические к трансзеатину
БАП бензиламинопурин, 6Ыбензиладенин
БСА бычий сывороточный альбумин
ДДС до деци л сульфат натрия
ЦСБ цитокининсвязывающий белок
ИУК индолил3уксусная кислота
ИФА иммуноферментный анализ
кДа килодальтон
ПААТ полиакриламидный гель
ЦСБ цитокининсвязывающий белок
1хлор, 2,4ди нитробензол
ВВЕДЕНИЕ


Изучение сродства белка АДК к различным гормонам и лигандам. Определение концентрации белка. Реакция транскрипции i vi. Определение количества сульфгидрильных групп с реактивом Эллмана. ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. Изучение активации транскрипции i vi ЦСБ. Поиск и идентификация ЦСБ ii i . ПУБЛИКАЦИИ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ. АТа. АТа. Исследование гормональной регуляции жизни растений является одной из центральных задач биохимии, физиологии и молекулярной биологии растений. Это объясняется тем, что вся жизнь растительных организмов, начиная от оплодотворенной яйцеклетки и кончая отмиранием и смертью, происходит под контролем фитогормонов. Фитогормоны играют важную роль в реакции растений на внешние воздействия и в формировании устойчивости растений к экстремальным условиям. Так как растения ведут сидячий образ жизни и привязаны к своему ареалу, они вынуждены приспосабливаться к изменяющимся условиям окружающей среды, например, ксенобиотикам и различным стрессам. Для раскрытия природы чувствительности клеток к гормональным сигналам исследуются свойства и структура рецепторов гормонов. Согласно современным представлениям специфический гормональный эффект обусловлен рядом событий, происходящих в результате взаимодействия гормона со специфическим белкомрецептором. Изучение механизма действия гормонов заключается в исследовании их рецепторов и процессов, приводящих к проявлению специфического гормонального эффекта. Кроме того, необходимый для воздействия уровень гормона и состав его форм поддерживается в клетке белками метаболизма гормона ферменты синтеза, распада, модификации, которые могут преобразовать активную форму гормона в неактивную, и с помощью такого механизма также регулируется жизнедеятельность клеток и органов. Пять основных групп растительных гормонов это ауксины, цитокинины, гиббереллины, этилен и абсцизовая кислота. Цитокининам принадлежит важная роль в течение всей жизни растений. Для цитокининов к настоящему времени известны мембранный рецептор гистидинкиназа I . Он участвует в активации ядерных генов первичного ответа . А цитокинином i . Кроме того, известны факты, которые говорят о существовании другого пути передачи цитокининового сигнала. В связи с этим были обнаружены ядерные цитокининсвязывающие белки, способные в присутствии цитокинина активировать транскрипцию i vi в транскрипционных системах, содержащих выделенные ядра или препараты хроматина Каравайко и др. Обнаружение как мембранного, так и кандидата в ядерные растворимые рецепторы цитокинина, говорит о сложности системы восприятия цитокининового сигнала и приводит к вопросу о разделении функций между этими рецепторами. Так как мембранный рецептор цитокинина в основном локализован в корне, возможно, что в надземной части рецепция цитокинина происходит с помощью других белков. Возможно также, что мембранный и растворимый рецепторы цитокинина необходимы одновременно в клетке, как это показано для стероидных гормонов животных. Мембранные рецепторы стероидных гормонов животных индуцируют быстрые ответы синтез вторичных передатчиков мессенджеров и активация сигнальных каскадов, ядерные рецепторы более медленные усиление или ослабление транскрипции определенных генов. Ядерные рецепторы стероидных гормонов млекопитающих контролируют экспрессию геновмишеней через образование гормонрецепторного комплекса, который связывается с промоторами генов. Для растений на настоящий момент такие данные отсутствуют. На растениях данные о механизмах взаимодействия различных сигналов пока ограничены, но на уровне физиологических эффектов хорошо известно взаимодействие цитокинина и ауксина, цитокинина и АБК и т. Разнообразие перечисленных параметров объясняет существование таких явлений, как полифункциональность гормонов, компетентность клеток к гормону, различие ответов на гормон разными тканями Розен, . Для понимания того, как гормональный цитокининовый сигнал регулирует рос и развитие растительного организма, проводится изучение белковрецепторов цитокинина, а также цитокининсвязывающих белков с другими функциями.