Стимуляция ангиогенеза в ишемизированном миокарде и скелетных мышцах с помощью транзиторной трансгенной экспрессии урокиназы

• Автор: Цоколаева, Зоя Ивановна
• Шифр специальности: 03.00.04, 03.00.13
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 140 с. : ил.

содержание урокиназы в среде культивирования

эндотелиальных клеток.

1.2. Влияние гипоксии на содержание белка и мРНК урокиназы в

эндотелиальных клетках.

1.3. Экспрессия рецептора урокиназы в условиях гипоксии

1.4. Влияние гипоксии на акгивность аденилатциклазы в эндотелиальных клетках

2. Динамика экспрессии эндогенной урокиназы в ишемизированном

миокарде крысы

3. Получение плазмидных конструкций, содержащих кДНК урокиназы и фактора роста сосудистого эндотелия УЕСР и проверка их функциональной активности

3.1 Конструирование плазмид

3.2 Проверка функциональной активности плазмид

3.2.1. Акгивность бетагалактозидазы в транфицированных клетках
3.2.2. Продукция белков фактора роста эндотелия сосудов и урокиназы в
транфицированных клетках
3.3.3. Определение экспрессии УЕСР5 по его биологической активности
4. Оценка эффективности трансфекции миокарда и скелетных мышц при прямом введении плазмид
4.1. Эффекгивность трансфекции скелетных мышц и миокарда при использовании внутрнмышечноговнутрнмнокардиалыюго
введения плазмидных конструкций
4.2 Динамика экспрессии трансгспов урокиназы и УБвР человека
в сердце крысы после введения соответствующих плазмид
5. Влияние трансгенной экспрессии урокиназы на ангио
артериогенез в периинфарктной зоне сердца крысы.
5.1. Количество сосудов в периинфарктной зоне после введения плазмид с генами урокиназы и УЕвЕ
5.2. Размера инфаркта при введении генов иРА и УЕвЕ в першшфарктную зону ссрдна крысы
5.3. Инфильтрация периинфарктной зоны моноцитамимакрофагами после ведения плазмид с генами урокиназы и УЕСЕ
6. Влияние трансгенной экспрессии урокиназы на ангиогенез в
ишемизированной задней конечности крысы и мыши
6.1 Количество капилляров в ишемизированных мышцах задней конечности крысы после введения плазмид с генами урокиназы и УЕСЕ
6.2. Восстановление кровотока и ангногенез в ишемизированной конечности мыши после трансгенной экспрессии урокиназы и УЕСЕ
бЗ.Развитие отека мышц при введении плазмид с генами урокиназы и УЕвЕ
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Целью работы было изучение возможности стимуляции неоваскуляризации ишемизированных тканей с помощью прямого введения в них плазмид с кДНК урокиназы на моделях ишемии скелетных мышц и миокарда у животных. Изучить влияние гипоксии на экспрессию н продукцию урокиназы эндотелиальными клетками человека и накопление урокиназы в срсдс культивирования этих клеток. Сконструировать плазмидиыс векторы, несущие кДНК человеческой, мышиной и крысиной урокиназы, человеческого УЕСЕ и маркерного гена бстагалактозндазы. Исследовать функциональную активность полученных плазмид на культу рах клеток. Исследовать эффективность трансфекции скелетных мышц и миокарда при прямом введении плазмиды с маркерным геном бстагалактозидазы оценить длительность экспрессии трапегепов в ишемизированном миокарде крысы с помощью вестернблоттиига и ОТПЦР. Изучить влияние прямого внутримиокардиального введения плазмид с кДНК урокиназы на ангно артериогенез в нериинфарктиой зоне и размер инфаркта миокарда у крысы. Изучить влияние прямого внутримышечного введения плазмид с кДНК урокиназы на автогенез и восстановление кровотока в ишемизированной задней конечности крысы и мыши, сравнить с эффектом УЕС и оценить эффект совместного введения двух генов урокиназы и УЕвЕ оценить влияние генной терапии на развитие отека конечности. Научная новизна и практическая значимость работы. В работе было впервые показано, что трансгепиая экспрессия урокиназы в ишемизированных скелетных мышцах и миокарде путем прямого введения плазмид несущих кДНК урокиназы стимулирует ангиоартериогенез и ускоряет восстановление кровотока в ишемизированных тканях. В отличие от УЕСР она не вызывает развития отека тканей в месте введения. Совместное использование генов урокиназы и УЕвЕ позволяет снизить дозу УЕОЕ без потери эффективности. Полученные данные указывают на урокиназу как на новый перспективный терапевтический ген для стимуляции ангио артериогенеза в ишемизированных тканях. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1. Формирование кровеносных сосудов и развитие сосудистой сети происходит главным образом в эмбриогенезе. Во взрослом организме образование новых сосудов или перестройка ремоделирование уже существующей кровеносной сети сопровождает восстановление поврежденных тканей например, ишемизированного миокарда и скелетной мышцы, заживление раневой поверхности, цикличекое обновление эндометрия у женщин, рост новообразований. Кровеносная сеть состоит из сосудов крупного диаметра артерий и вен, промежуточных артериол и венул и капиляров. Последние представляют собой трубчатые структуры стенки которых сформированы эндотелиальными клетками. С увеличением диаметра сосудов в формирование стенки сосуда вовлекаются другие типы клеток перициты, гладкомышечные клетки, фибробласты, которые придают сосуду жесткость и упругость. i i , . Рост и ремоделирование сосудистой сети может происходить в результате трех процессов васкуло, ангио или артериогенеза. Васкулогенезом принято называть образование сосудов v, в результате дифференциации эндотелиальной клетки из своего предшественника ангиобласта. Ангиогенез это процесс формирования сосудистой сети благодаря пролиферации и миграции эндотелиальных и гладкомышечных клеток уже существующего сосуда с формированием сосудистого отростка и последующим прорастанием в области ишемии, воспаления или в очаги злокачественных новообразований. Процесс артериогенеза, представляет собой перестройку уже сформированного сосуда, направленную, в основном, на увеличение его массы и просвета. Артериогенсз это наиболее эффективный механизм компенсации недостаточного кровоснабжения при сужении или окклюзии артерий, так как обеспечивает поступление крови в обход места окклюзии или сужения за счет быстрого развития коллатеральных сосудов i i , . И капиллярный кровоток, распределяющий кровь на самом низком уровне внутри ткани, и артериальный кровоток, осуществляющий основную поставку крови и ее распределение по органам и тканям в соответствии с физиологическими потребностями, необходимы для эффективного обеспечения тканей кровыо.