Структурно-функциональное исследование изолированных доменов АТР-зависимой Lon-протеиназы Escherichia coli

• Автор: Андрианова, Анна Говардовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 141 с. : ил.

Введение.
1. Активные центры зависимых протенназ и протеолитических комплексов, осуществляющих селективную внутриклеточную деградацию белков Обзор литературы.

1.1. Семейство АААбелков.

1.1.1 .Структурные особенности АААбелков.

1.1.2. Классификация АДАбелков

1.1.3. Функции АААбслков

1.1.3.1. Классификация, структура и функции шаперонов

1.1.3.2. Регуляция межбелковых взаимодействий

1.1.3.3. ДНКсвязывающие представители АААсемейства

1.1.3.4. Молекулярные моторы.

1.1.4. Биологическая роль АЛД1белков.

1.2. Типы активных центров зависимых протеиназ и протеолитических комплексов
1.2.1. Металлопротеиназа
1.2.2. Классическая каталитическая триада. Протеиназы и X.
1.2.3. Треониновые протеиназы IV и протеасомы
1.2.4. Каталитическая диада .
1.2.4.1. протеиназа
1.2.4.2. x
1.2.4.3. Сигнальная пептидаза типа 1.
1.2.4.4. Протеииаза
1.2.4.5. Пептидаза
1.2.4.6. Неканонические протеиназы.
1.3. Заключение.
2. Результаты работы и их обсуждение.
2.1. Общая характеристика протеиназы . i
2.2. Выделение протеиназы . i.
2.3. Ограниченный про геолиз протеиназы химотрипенном.
2.4. Разделение и очистка фрагментов протсиназы.
2.5. Структурная характеристика протеиназы и се фрагментов
2.5.1. Микрокалориметрическое исследование протеиназы и ее изолированных фрагментов
2.5.2. Третичная структура фрагментов протеиназы
2.5.2.1. Третичная структура аспирализовашюго домена протеиназы
2.5.2.2. Третичная структура протсолитичсского домена протеиназы
2.5.3. Олигомерное состояние протеиназы и ее фрагментов
2.6. Сравнителытя характеристика функциональной активности протеиназы и ее изолированных фрагментов
2.6.1. АТРазная активность протеиназы и ее химотриптических фрагментов
2.6.2. Псптидазная активность I.протеиназы и ее укороченных форм
2.6.3. Протсолитическая активность протеиназы и сс укороченных форм.
2.7. Заключение
3. Эксперименатальнаи часть.
3.1. Материалы
3.1.1. Реактивы
3.1.2. Штаммы . i
3.1.3. Растворы
3.1.4. Культуральные среды.
3.2. Методы
3.2.1. Процедуры, использованные при работе с клетками.
3.2.2. Процедуры, использованные при работе с плазмидной ДНК.
3.2.3. Выделение и очистка протеиназы и се фрагментов
3.2.4. Ограниченный протсолиз протеиназы химотрипсином.
3.2.5. Определение олигомерного состояния
3.2.6. Тестирование ферментативной активности
4. Выводы.
5. Литература.
Список сокращений
а.о. аминокислотный остаток е.а. единица активности
оптическая единица
нуклеотид
АТР аденозин5трифосфат
аденозин5дифосфат
5аденил ил, vим идоди фосфат АМРСРР аденозин5 а,рмети лентрифосфат гуаюзин5трифосфат
сукцинил
тиобензил параиитроашишд
Мм молекулярная масса.
Введение


Кроме того, для белков, содержащих один , таких как V4 и катании, было обнаружено равновесие мономергексамер, причем олигомерное состояние реализовывалось только в присутствии негидролизуемого аналога АТР или при связывании субстрата микротрубочки в случае катанина и неизвестный эндосомальный белок для V4 . Асимметричные кольца могут быть образованы в результате взаимодействия между гетеротипными доменами. Так, длинная полипептидная цепь моторного домена белка динеина формирует гептамерную кольцевую структуру. По сравнению с гомотнгшыми АТРазными доменами, образующими симметричные кольца катанина и , разные домены в динеине выполняют разные функции. Активный центр Р1 первого домена является главным ферментативным центром, который определяет скорость гидролиза АТР белком в целом, в то время как центры следующих трех АААдоменов Р2 Р4 гидролизуют нуклеотид менее эффективно, возможно, выполняя при этом регуляторную функцию. Два последних домена могут служить структурным завершением кольца, а также взаимодействовать с субстратом. Структура и доменов белка . Выделен фрагмент, включающий тяж , остаток 1, короткую спираль, ар гн ни новый палец и тяж . Предполагается, что взаимодействие между нуклеотидсвязываюшими центрами соседних субъединиц опосредовано изменениями положения полипептидного фрагмента, соединяющего 1 и аргнниновый палец, происходящими при гидролизе нуклеотида. Вес АААмодули в кольцевой структуре взаимодействуют кооперативно, так что инактивация АТРазного центра одного из них приводит к значительному понижению активности всего комплекса. На примере семейства С1рпротеиназ было показано, что нуклеотидсвязывающие сайты одного АТРазного кольца обладают различным сродством к АТР. Взаимодействие нуклеотида с одними сайтами более стабильно, чем с другими. В то же время в олигомере остаются свободные АТРазные центры. Согласно существующей в настоящее время модели рис. АТР может связаться с любым из нуклеотидсвязывающих сайтов, что приводит к структурной асимметрии, изменению конформации АТРазных субъединиц и
формированию центров с разными свойствами . Суперсемейство АААбелков относится к наиболее представительному классу нуклсозидтрифосфатаз аз ферментов, в активном центре которых локализован консервативный фрагмент, называемый Рпетлей Р 5. Рпетлевой домен представляет собой структуру типа трехслойного арсэндвича. Такие нуклеозидтрифосфатазы гидролизуют руфосфагную связь в связанном нуклеотиде чаще всего, АТР или ГР. Рис. Модель взаимодействия гексамера С1рХ с нуклеотидами и субстратом. А Связывание первых двух молекул АТР приводит к структурным изменениям в центральной полости С1рХ связывание дополнительных молекул АТР стабилизирует конформацию, способную взаимодействовать с субстратом. БГ Показано возможное состояние субъединиц в гексамсрс СрХ. Желтые субъединицы не связывают АТР. АТР связывается раньше, чем с синими. Связывание нуклеотида в АТРазных центрах синих субъединиц способствует их взаимодействию с субстратами . Р1оорбелков. Эволюционно Р1оорбелки подразделяются на два больших класса i и ii i Е. Согласно принятой в настоящее время эволюционной классификации суперсемейство АААбелков состоит из различных семейств и нескольких групп белков, которые объединены в пять ветвей рис. АААмодули известных зависимых протеиназ представлены в двух из пяти ветвей в i и в X 9. К ветви ААА классические наряду с другими, непротеолитичсскими ААА белками относятся АТРазные субъединицы протеасом и бактериальная зависимая прогеиназа , у которой АААмодуль локализован в единой полипептидной цепи с доменом, представляющим металлопротеиназу. Ко второй ветви относятся АТРазные субъединицы протеиназ , X, V, АТРазные домены протеиназ и ряд шаперонов. Семейство X широко распространено в бактериях и полностью отсутствует в протеомах архей. Интересно отметить, что несмотря на принадлежность и С1рХ к одному семейству ААААТРаз, их протеолитические партнеры субъединицы V и С1рР относятся к неродственным семействам i писеор1п1егидролаз и ацилСоАдекарбоксилазизомераз, соответственно. Протеиназы представлены в ветви X двумя линиями i и рис.