Структурная организация и каталитические свойства микросомальной гидроксилирующей системы

• Автор: Курченко, Владимир Петрович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1983
• Место защиты: Минск
• Количество страниц: 189 c. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ХАРАКТЕРИСТИКА ШКРОСОМАЛЬНОЙ ГИДРОКСИЛИРУЮЩЕй СИСТЕМЫ Обзор литературы

I. Распространенность системы и ее функции

2. Состав гидроксилирующей системы микросом печени

и множественность форм цитохрома Р0 . . . .

3. Механизм действия гидроксилирующей системы

микросом печени .

Постановка задачи

ГЛАВА II. МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТА

I. Исходные вещества.

2. Методы выделения микросом, цитохромов Р0 ЛМг,
Р0 ЛМ, Вд и НАДФНцитохром Р0 редуктазы
1. Ввделение микросом
2. Ввделение и очистка цитохрома Р0 ЛМ из микросом печени кроликов получавших фенобарбитал натрия
3. Ввделение и очистка цитохрома Р0 ЛМ из микросом печени кроликов, получавших метилхолантрен
4. Ввделение и очистка НАДФНцитохром Р0 редуктазы .
5 Ввделение цитохрома
3. Иммунохимические методы . .
4. Выделение фосфолипидов и получение липосом и
протеолипосом .
5. Электрофоретические методы.
6. Кинетические методы
7. Ингибиторный анализ
8. Методы анализа
I. Химические методы
2. Спектральные методы
9. Методы характеристики реакций
ГЛАЗА III. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГИДРОКСИЛИРУЮЩЕЙ СИСТЕМЫ МИКРОСОМ ПЕЧЕНИ.
I. Характер взаимодействия НАДФНцитохром Р0 редуктазы и цитохрома Р0 ЛМ.
1. Встраивание цитохрома Р0 ЛМ в микросомальные мембраны. . .
2. Иммунохимическое изучение каталитической активности цитохрома Р0 Лу.
3. Реконструкция микросомальной гидроксилирующей системы, содержащей цитохром Р0 ЛМ2.
2. Каталитические свойства системы, включающей цитохром Р0 ЛМ
1. Встраивание цитохрома Р0 ЛМ в микросомальные мембраны
2. Иммунохимическое изучение каталитической активности цитохрома Р0 ЛМ.
3. Сравнение каталитической активности цитохромов Р0 ЛМг и Р0 ЛМ в реконструированных системах
ГЛАВА У. РОЛЬ ЦИТОХРОМА В В ОКИСЛЕНИИ АНИЛИНА И ДИМЕТИЛАНИЛИНА МИКРОСОМАМИ И РЕКОНСТРУИРОВАДОЫШ МИКРОСОМАЛЬ
ГЛАВА У. РОЛЬ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В ОКИСЛЕНИИ ДИШТИЛАНИЛИНА И АНИЛИНА.
I. Суперокисный анион 0 как возможный активный агент
I. Ингибирующее действие соединений меди на окислительное деметилирование диметиланилина микросомами печени .
НЫМИ СИСТЕМАМИ
при окислении диметиланилина цитохромом Р
2. Ингибирующее действие соединений меди при окислении диметиланилина гидроперекисью кумила с участием цитохрома Р0 .
2. Вклад радикальных реакций в окисление диметиланилина
и анилина с участием цитохрома Р0
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
ЛИТЕРАТУРА


Скорость реакций деалкили рования третичных аминов определяется рядом факторов, в числе кото рых растворимость субстратов в липидах мембран ЭР. С ростом липофильности третичных аминов увеличивается скорость микросомального деалкилирования 4б . Реакции Одеалкилирования также протекают с участием Р0. Скорость реакции определяется положением замещающей группы в кольце и ее длинной б С ростом длины алкильной группы скорость деалкилирования падает 5,б . В присутствии микросом печени идут также реакции деалкилирования тиоэфиров, метилбарбитуратов, пметилкарбаматов з,5,б . Н НАДФ. деалкилирование аминов катализирует только Р0, а образование окисей Р0 и другой фермент аминооксидаза 5,б. Р0 обеспечивает окисление ДМА до его окиси на . Остальная окись превращается аминооксидазой КФ. Фермент вьщелен из микросом печени свиньи и очищен до гомогенного состояния. Молекулярный вес аминооксидазы равен 0. ФАД в концентрации ,2 нМ фдавина на мг белка. Фермент является типичной монооксигеназой, которая на первой стадии реакции связывает НАДФН, затем и, наконец, окисляемый субстрат . Таким образом, широкая распространенность гидроксилирующих си стем в различных органах и тканях, а также большой круг реакций, катализируемых ими, свидетельствуют о важной роли, которую они играют в защите организма от внешних воздействий и в биосинтезе ряда эндогенных соединений. Состав гидроксилирующей системы микросом печени и множественность форм цитохрома Р0. Как уже упоминалось, микросомальная ферментная система гидроксилирования содержит НАДФНцитохром Р0 редуктазу, цитохром Р0 и фосфолипиды . В некоторых реакциях гидроксилирования непосредственное участие принимает цитохром бо . НАДФНцитохром Р0 редуктаэа. Основная роль редуктазы заключается в транспорте электронов от НАДФН на цитохром Р0, являющийся терминальным акцептором элек тронов. Редуктаза прочно связана с мембраной. Выделение НАДФНцитохром Р0 редуктазы из микросом с применением детергентов позволило получить гомогенный белок. Он представляет собой флавопротеид с молекулярной массой около 0, образующий в растворе ассоциаты с молекулярным весом около . Фермент содержит по одной молекуле флавинадениндинуклеотида и флавинмононуклеотида на полипептидную цепь. Спектр поглощения редуктазы в окисленном состоянии имеет три максимума на 7, 0, 5 нм. Коэффициент молярной экстинции очищенного флавопротеида при длине волны 5 нм равен мМсм ,. Кд РеСЮ6 . Р0 является одноэлектронным акцептором . Так как фермент обладает высоким сродством к одному из своих субстратов цитохрому С его часто называют НАДФНцитохром С редуктаза. При введении животным фенобарбитала натрия активность редуктазы возрастает в 23 раза 4. НАДФНцитохром Р0 редуктаза, вьщеленная из микросом животных, получавших фенобарбитал натрия или другие индукторы, не отличается по своим каталитическим, спектральным и иммунохимическим свойствам от флавопротеида интактных микросом б4. Показано сходство иммунохимических и каталитических свойств НАДФНцитохром Р0 редуктазы, полученной из печени и почек свиньи . При использовании протеолиза в процедуре вьщеления редуктазы, молекулярная масса белка снижается до 0, а фрагмент с молекулярной массой остается в мембране. Малый пептид имеет гидрофобную природу и является частью нативной НАДФНцитохром Р0 редуктазы, ответственной за ее связывание с Р0. Об этом свидетельствует неспособность флавопротеида, солюбилизированного трипсином, восстанавливать Р0, хотя активность по отношению к цитохрому С сохраняется. Гидрофобный пептид является фрагментом концевой области НАДФНцитохром Р0 редуктазы. Это подтверждается идентичностью Сконцевой аминокислотной последовательности флавопротеидов, полученных с использованием протеолиза и солюбилизации микросом детергентами бб . В аминокислотном составе редуктазы гидрофобные аминокислоты составляют , белок содержит 6 цистеинов и один триптофан . Во взаимодействии НАДФН с флавопротеидом важная роль принадлежит тиоловым группам, что подтверждается инактивацией белка при модификации трех БНгрупп 5,5дитиобис2нитробензоатом.