Регуляторные аспекты биосинтеза эктоина у аэробных метилотрофных бактерий

• Автор: Мустахимов, Ильдар Ильдусович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 95 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. Галофильные микроорганизмы

1.1. Осмоадаптация.

1.2. Гиперосмотическнй шок.

1.3. Спектр совместимых растворимых веществ

ГЛАВА 2. Биосинтез эктоина и гидроксиэктоина.

2.1. Гены и ферменты биосинтез эктоина и гидроксиэктоина.

2.2. Регуляция биосинтеза эктоина

ГЛАВА 3. еемейство транскрипционных регуляторов.
3.1. Транскрипционные регуляторы семейства
3.1.1. Регуляторы ответа на стресс и факторов вирулентности
3.1.2. Регуляторы генов катаболизма ароматических соединений.
3.2. Структурная организация белков семейства .
3.3. Механизм транскрипционного контроля экспрессии генов
белками семейства.
ГЛАВА 4. Осмоадаптация аэробных метилотрофных бактерий.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 5. Материалы и методы исследования.
5.1. Культивирование бактерий
5.2. Выделение геномной ДИК
5.3. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции.
5.4. Очистка фрагментов ДНК
5.5. Лигирование фрагментов ДНК
5.6. Получение компетентных клеток и их трансформация
5.7. Выделение плазмид из рекомбинантных клонов
5.8. Полимеразная цепная реакция ПЦР и создание праймеров
5.9. Определение и анализ последовательностей нуклеотидов
5 Клонирование и экспрессия генов и
5 Очистка и определение молекулярной массы рекомбинантных белков
5 Определение активности и характеристика ДДБацетилтрансфераз.
5 Деления гена у метанотрофа ii ii
5 Выделение РНК.
5 Метод удлинения праймера
5 Анализ образования комплексов ЕсК ДИК методом задержки в геле
5 Защита ДИК белком от воздействия ДНКазы 1.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
ГЛАВА 6. Очистка и первичная характеристика рекомбинантных
ДАБацетилтрансфераз метилотрофных бактерий.
ГЛАВА 7. Идентификация и определение функциональной активности генов есК
метилотрофных бактерий
7.1. Идентификация генов есЯ у мешлотрофных бактерий.
7.2. Определение функциональной активности белка ЕсК еИуопгсгоЬит ЫсаИрЫЫт 2
ГЛАВА 8. Определение стартовых точек транскрипции соперона и гена еаК
у МекуотсгоЬит асарЬит 2Л6 и 4 Иааухса.
8.1. Определение стартовой точки транскрипции есАонерона
8.2. Определение стартовой точки транскрипции генов есЯ
ГЛАВА 9. Очистка и характеристика транскрипционных реуляторов ЕщК
метилотрофных бактерий
9.1. Сравнительный анализ белков Ес галофильшлх бактерий.
9.2. Очистка и первичная характеристика транскрипционных регуляторов ЕсЯ
из ШИуотсгоЬит асарЬит и 1 Ьаахса
Заключение
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Поскольку накопление осмолитов бактериями процесс, зависимый от внешней солености, логично полагать, что существует специфическая регуляция биосинтеза эктоина на биохимическом и генетическом уровнях. Однако, несмотря на интенсивные исследования физиологии и биохимии продуцентов эктоина, ферменты, катализирующие реакции биосинтеза эктоина, частично охарактеризованы только у гетеротрофной бактерии . ЕйА для выявления эффекторов, влияющих на их активность, а также регуляцию транскрипции оперона сс ЛВСахк у галоанкалофильных метилотрофных бактерий. Цель н задачи исследовании. Цель данной работы изучение регуляции биосинтеза эктоина аэробными галоалкалофильными метано и метилотрофными бактериями на уровне активности ферментов биосинтеза эктоина и транскрипции сс11ВСмк оперона. Выделить и охарактеризовать рекомбинантные ДАБацетилтрапсферазы Ес1А из метанотрофа Мт. ИрИИит 7 и метилобактерий М. ЫсаИса и М. НгаБка. Определить нуклеотидные последовательности генов емЯ, кодирующих предполагаемые транскрипционные регуляторы есМВСазк оперонов у Мт. ИрИИит , М. Иса и М. Иа1тса. Определить промоторные области есАВСазк оперонов и генов есШ у Мт. ИрИИит 7 и М. Иа1аяка. Выделить и охарактеризовать предполагаемые транскрипционные белкирегуляторы НсК из Мт. ИрИИит и М. Иак. Научная новизна. Получены и охарактеризованы рекомбинантные ДАБацетнлтрансферазы. Показано, что свойства ДАБацетилтрансферазы коррелирует с экофизиологпческими особенностями изучаемых бактерий. Впервые установлено, что регуляция биосинтеза эктоина у изучаемых метилотрофных бактерий происходит на уровне транскрипции еМАВСазк оперона. Определено, что оперон ес1АВСаьк у Мт. ИрИИит 7 и М. Иа1амка транскрибируется с двух промоторов Р1 и Р2. Выше ееоперона обнаружены гены есЯ, кодирующие белки, гомологичные белкамрегуляторам семейства МагИ Получены и охарактеризованы гомогенные препараты белков БсШ, показана их способность обратимо связываться с Р1 промоторной областью есоисрона в пределах предполагаемой последовательности. Уровень экспрессии с промотора Р1 регулируется белком ЕсК и увеличивается в условиях высокой осмолярности среды, тогда как с промогора Р2 осуществляется низкая конститутивная экспрессия генов биосинтеза эктоина, не регулируемая продуктом гена есЯ. Найдено, что у Мт. ИрИИит 2, в отличие от М. Р1 и 2 оперона. Предполагается, что транскрипция гена у . контролируется собственным продуктом, т. является ауторегулятором. Практическое значение работы. Данная работа расширяет наши представления о регуляции биосинтеза эктоина и создает предпосылки для эффективной реализации биотехнологического потенциала галоалкалофильных метанотрофов и метилобактерий, как возможных продуцентов биопротектора эктоина. Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на ежегодных отчетных конференциях ИБФМ РАН гг, на 8, 9 и ой международных школахкопфереициях молодых ученых Путцино, гг. Всероссийской молодежной школеконференции Актуальные аспекты современной микробиологии Москва, и , на международной научной конференции Современные проблемы микробиологии и биотехпологии Одесса, , на международной научной конференции Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии Минск, , на школеконференцин Биология традиции и инновации в веке Казань, . Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи и 7 тезисов. Место проведения работы. Экспериментальная часть работы выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов в рамках плана научноисследовательских работ УРАН ИБФМ РАН по теме Экстремофильныс и экстремотолерантные аэробные метшютрофы Госрегистрации . Благодарности. Автор благодарен сотрудникам УРАН ИБФМ РАН, способствовавшим выполнению и написанию дайной диссертационной работы д. Дорониной , к. Шляпникову М. Г., к. Ивашиной Т. В., к. Захаровой М. В., ст. Вотсвой Г. В., а также сотрудникам УРАН ИБ РАН к. Ксензеко В. Н. и Глухову . . Особую признательность автор выражает своим научным руководителям д. Троцснко Ю. А., д. Хмелсниной В. Н. и к. Решетникову . Структура и объем работы. Диссертация изложена на сгр.