Свойства и роль пирофосфатзависимой 6-фосфофруктокиназы Methylomonas Methanica

• Автор: Бесчастный, Александр Павлович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 134 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава I. Общая характеристика аэробных метилотрофных бактерий

1.1. Таксономическое разнообразие аэробных метанотрофов

1.2. Пути окисления С соединений у метилотрофных бактерий.

1.3. Система транспорта электронов и окислительное фосфорилирование.

1.4. Пути ассимиляции С соединений

1.5. Центральный метаболизм.

Глава 2. Энзимологические аспекты метаболизма неорганического пирофосфата.

2.1. Пуш образования и локализация ФФ в клетках

2.2. Пирофосфатзависимые ферменты микроорганизмов.

2.3. Характеристика и метаболическая роль неорганических пирофосфатаз.
2.4. Свойства и метаболическая роль ПФК.
2.5. Филогенетический анализ и эволюция ПФК.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 3. Объекты и методы исследования
3.1. Обьекгы исследований.
3.2. Культивирование бактерии.
3.3. Методы разрушения клеток и получения бссклсточных экстрактов.
3.4. Измерение активности ферментов.
3.5. Очистка ПФК из М. гпмИапка
3.6. Очистка пирофосфатазы из М.те1Ьапка .
3.7. Электрофоретические методы.
3.8. Иммуноцитохимическое выявление ПФК в клетках М.тмИатса
3.9. Гельхроматография.
3 Определение кинетических параметров ПФК и ФФазы.
3 Включение Роргофосфата в ФФ и Фр1,6Ф2 в реакции ПФК т хИго
3 Молекулярнобиологические методы
. Манипуляции с хромосомной ДНК М. теИапка
. Методы с использованием ПЦР.
. Выделение плазмид из рекомбинантных клонов
. Секвенирование ПЦР продуктов
. Филогенетический анализ генов ПФК и АТФФФК.
. Клонирование, экспрессия и очистка рекомбинантной ПФК.
3 Аналитические методы
Глава 4. Результаты и обсуждение
4.1. Распространение ПФК у аэробных метилотрофных бактерий
4.2. Влияние условий культивирования тейюпка на активность ПФК и ФФназы
4.3. Внутриклеточная локализация ФФнзависимых ферментов 4.i
4.4. Очистка и характеристика ПФК М. тевюпка .
4.5. Очистка и характеристика неорганической пирофосфатазы М. таИапка
4.6. Секвенирование гена ПФК А. текапка
4.7. Клонирование и экспрессия гена ПФК М теОшпка .
4.8. Метод биосинтеза ФФН, меченного фосфором Р
Заключение
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


При этом только часть ростового субстрата используется для ассимиляции, тогда как другая часть должна быть полностью окислена до СО2 для снабжения клегок энергией. Н Сериновый цикл цикл Кальвина
Рис. Схема окислении Ссосдшсшш у мстилотрофных бактерий. Известно два вида ММО растворимая, локализованная в цитоплазме рММО, и мембрансвязанная, ассоциированная с мембранами мММО. Последняя присутствует у большинства изученных метанотрофов, за исключением бактерий рода . Лишь немногие метанотрофы имеют обе формы фермента, причем наличие рММО является штаммовым свойством. ММО индуцибельный фермент, единственным фактором, определяющим его активность в клетках, является соотношение содержания меди к биомассе . Гены, кодирующие мММО, организованы в оперон ртоСЛВ. У . ОВЗЬ в хромосоме обнаружены две практически идентичные копии этого оперона . Ас. С . Для проявления активности мММО, кроме катионов меди, необходимы и ионы железа i, , . Донорами электронов для очищенной ферментной системы могут служить аскорбат, дурохинол и метанол, но не НАДФН. ММО имеет высокое сродство к метану Км мкМ и кислороду Км 0,1 мкМ и узкую субстратную специфичность, окисляя, помимо метана, лишь алканы, алкены и метанол i, i, . ММО соокисляет широкий спектр ароматических, гетероциклических, ациклических и галогенированных углеводородов . Км3 мкМ и кислороду Км,8 мкМ и функционирует только при низких концентрациях меди в среде 0,8 мкМ i i, . ММО ферментный комплекс, состоящий из трех компонентов гидроксилазы А, редуктазы С и регуляторного белка В. Гидроксилазный компонент представляет собой комплекс I2 0 кДа с м. Да а, Р и у кДа, причем асубъединица имеет двуядерный негемовый железный центр i i, . Редуктазный компонент ,4 кДа содержит ФАД и Ге2кластер. Редуктаза акцептирует электроны от НАДН, перенося их на двужелезный сайг гидроксилазы. Регуляторный белок В ,8 кДа не содержит простетической группы и кофакторов, но связывается с гидроксилазным компонентом и необходим для эффективной работы рММО i . Экспрессия рММО регулируется на уровне транскрипции . Окисление метанола до формальдегида катализируют метанолдегидрогеназы МДГ. НАДФнезависимая МДГ, состоит из двух а кДа и двух Р 8,5 кДа субьединиц, имеет две молекулы и один атом кальция , и характерна для большинства грамотрицательных мстилотрофных бактерий, в том числе метанотрофов. ФМС или другие искусственные акцепторы электронов, i viv электроны передаются на цитохром с i . Генетические исследования i x I показали участие генов в окислении метанола , i, . Три из этих генов кодируют структурные белки x кодирует большую , x малую субъединицы МДГ, а x кодирует цитохром i первичный акцептор электронов, поступающих от МДГ , , . В свою очередь, цитохром а окисляется цитохромом сн , . Показано, что x является одним из наиболее консервативных структурных генов у метилотрофных бактерий i . В этом кластере обнаружен набор генов, последовательности которых гомологичны таковым гстеродимерной МДГ, найденной у других метилоторфов . Исследование полного генома Ыс. МДГ. Среди них гомологи x, x, обнаруженные у А. I, кодирующие а и субъединицы МДГ, и гены других белков, необходимых для функционирования МДГ . Окисление формальдегида. Формальдегид ФА является центральным метаболитом, поступающим в первичные пути ассимиляции РМФ и сериновый, а также подвергающимся дальнейшему окислению с получением восстановительных эквивалентов и энергии. СОз. У метилотрофов ФА может окисляться до формиата формальдегиддегидрогеназой ФАДГ. У Мс. ФАДГ, содержащая . Фермент, возможно, ассоциирован с ЭТЦ через цитохром 6типа или хинон . У i обнаружена НАДФФАДГ, по структуре гена и энзиматическим свойствам отнесенная к III классу алкогольдегидрогеиаз , . ФАДГ . ОВЗЬ состоит из двух идентичных субъединиц. Акцепторами электронов ФАДГ служили ФМС, ФЭС и ДХФИФ. Предполагается, что фермент является гемопротеином, содержащим гем стипа . ФАДГ, содержащая связанный НАД, обнаружена у метилобактерий . Р1 и i i . Фермент . ФАДГ ii vii V0 является гомотстрамсром и в качестве простетической группы, возможно, содержит i .