Разработка метода дифференциального выявления микобактерий туберкулезного комплекса с использованием однопробирочной многоцикловой амплификации двух геномных нуклеотидных последовательностей

• Автор: Хорошева, Евгения Марковна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 95 с. : ил

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биология и эпидемиология микобактерий туберкулезного комплекса

1.2. Применение методов молекулярной биологии к эпидемиологии туберкулеза

1.2.1. Видоспецифичные белки микобактерий

1.2.2. Видоспецифичные нуклеотидные последовательности

геномов микобактерий.

1.2.3. Типирование изолятов возбудителей туберкулеза по количеству и местам интеграции в бактериальную хромосому инсерционного элемента

1.2.4. Применение ПЦР для детекции ДНК микобактерий в клинических

образцах, . Л

1.3. Современные способы обнаружения микобактерий,

их недостатки и преимущества.
1.3.1. Специфичность и чувствительность детекции микобактерий методом
ПЦР. Факторы на них влияющие.
Заключение.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы и реактивы, использованные в работе.
2.1.1. Реактивы .
2.1.2. Ферменты
2.1.3. Использованные в работе бактериальные штаммы
2.1.4. Векторные ДНК.
2.1.5. Буферные среды и системы
2.2. Выделение препаратов ДНК
2.2.1. Выделение геномной ДИК
2.2.1.1. Выделение ДНК из микобактерий.
2.2.1.2. Выделение геномной ДНК из белых клеток крови
2.2.1.3. Выделение ДНК из клинических образцов.
2.2.1.4. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е.соИ
а Выделение плазмидной дцДНК с использованием щелочного лизиса
б Выделение плазмидной дцДНК с использованием ионообменной хроматографии.
2.3. Амплификация ДНК в системе ПЦР.
а Однораундовая ПЦР
б Двухраундовая ПЦР
в многоцикловая мультпраймерная ПЦР
2.4. Ферментативная обработка препаратов ДНК
2.4.1. Гидролиз Д1Ж эндонуклеазами рестрикции.
2.4.2. Лигирование фрагментов дцДНК с использованием ДНКлигазы бактериофага Т4.
2.5. Анализ и очистка препаратов ДНК методами гель
электрофореза.
2.5.1. Электрофорез в гелях агарозы.
2.5.2. Электрофорез в полиакриламидном геле.
2.5.3. Выделение ДНК из гелей электроэлюцией в ячейках фирмы ГБСО
2.5.4. Выделение ДНК из агарозного геля методом сорбции на стекловолокне.
2.5.5. Очистка олигонуклеотидов в денатурирующем полиакриламидном геле с
непрерывной элюцией и спектрофотомегрической детекцией.
2.6. Получение компетентных клеток Е.соН и их трансформация плазмидной
2.7. Фотографирование окрашенных фрагментов ДНК.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Выбор нуклеотидных последовательностей геномов патогенных микобактерий для разработки способов детекции и типирования возбудителей туберкулеза.
3.2. Выбор оптимального метода выделения ДНК из микобактерий
3.3 Выбор олигонуклеотидных праймеров для амплификации и детекции мишеневых нуклеотидных последовательностей геномов патогенных микобактерий
3.4. Подтверждение специфичности амплификации выбранных для диагностики нуклеотидных последовательностей
3.5. Разработка способа выявления геномных ДНК представителей МТК с одновременной идентификацией ДИК МЛиЬегсикв, основанного на методе
двухраундовой ПЦР
3.6. Разработка способа дифференциального выявления геномных ДНК возбудителей туберкулеза, основанного на методе однораундовой многоцикловой мультиплексной ПЦР.
3.6.1. Подтверждение видоспецифичности нуклеотидных последовательностей, выбранных для амплификации методом многоцикловой однораундовой
3.6.2. Конструирование рекомбинантной ДНК внутреннего стандарта
3.6.3. Подбор условий проведения одновременной многоцикловой однораундовой амплификации выбранных нуклеотидных последовательностей совместно с ДНК внутреннего стандарта.
3.6.4. Апробация разработанного метода дифференциального выявления микобактерий туберкулезного комплекса с использованием однопробирочной многоцикловой амплификации двух геномных нуклеотидных
последовательностей
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Подтверждение видоспецифичности нуклеотидных последовательностей, выбранных для амплификации методом многоцикловой однораундовой
3. Подбор условий проведения одновременной многоцикловой однораундовой амплификации выбранных нуклеотидных последовательностей совместно с ДНК внутреннего стандарта. ВЫВОДЫ. Ма моноклональное антитело. ВВЕДЕНИЕ. В последние годы во всем мире отмечается рост заболеваемости туберкулезом. Ежегодно выявляется около 8 миллионов новых случаев туберкулеза и около 3 миллионов людей умирают от этой инфекции . Известно, что взрослого населения нашей планеты инфицированы туберкулезом. Риск возникновения болезни у инфицированного человека составляет приблизительно на каждые лет его жизни 2. По прогнозам Всемирной организации здравоохранения за год, в период между и годами один миллиард людей будет инфицирован туберкулезом. Активный туберкулез разовьется у 0 миллионов человек, из них у миллионов развитие туберкулеза приведет к летальному исходу, если для сдерживания развития и распространения этого заболевания будут использоваться те же методы диагностики и лечения, которыми здравоохранение располагает на сегодняшний день. В практической медицине и ветеринарии для выявления возбудителей туберкулеза градиционно используют метод световой микроскопии и метод культивирования микобактерий на селективных средах. Световая микроскопия является быстрым методом на проведение анализа требуется несколько часов, но характеризуется низкой чувствительностью 3. Метод выявления возбудителей туберкулеза при помощи культивирования микроорганизмов на селективных средах, обладает высокими чувствительностью и специфичностью около 0. Однако, поскольку возбудители туберкулеза характеризуются медленным ростом деление происходит 1 раз в часов 2, то применение метода культивирования микобактерий требует значительных затрат времени около 8 недель 4. Создание в последние десятилетия библиотек генов туберкулезных бактерий, а также накопление информации о видовой специфичности белков и нуклеотидных последовательностей возбудителей туберкулеза, предоставляют возможность использовать некоторые методы молекулярной биологии для быстрой идентификации ДНК возбудителей туберкулеза. В последние годы для выявления возбудителей туберкулеза созданы зарубежные и отечественные диагностические тесты на основе полимеразной цепной реакции ПЦР, которые характеризуются одновременно высокими чувствительностью, специфичностью и скоростью проведения анализа 5, 6, 7, 8, 9,0. Однако, применение метода ПЦР в лабораторной диагностике туберкулеза выявило ряд специфических проблем. Прежде всего, при проведении двухраундовой ПЦР возникает риск перекрестной контаминации реакционных смесей ампликонами первого раунда и, как следствие этого, получение ложноположительных результатов анализа . Проведение же ПЦР за один раунд не обеспечивает высокой чувствительности выявления микобактерий . ДНК микобактерий из клинических образцов, от 2,6 до препаратов могут содержать ингибиторы термостабильной ДНКиолимеразы 6, 7, 8, , приводящие к ложноотрицательным результатам анализа. Правильный подбор для амплификации нуклеотидных последоватсльностсймишенсй, строго специфичных для возбудителей туберкулеза, консервативных и присущих геномам всех изолятов МТК также влияет на специфичность и чувствительность выявления возбудителей туберкулеза ,. Очевидно, что преимущества метода ПЦР как такового, могли бы быть использованы в большей или меньшей степени в зависимости от решения данных проблем при разработке дизайна способа диагностики туберкулеза. Таким образом, разработка достоверного метода быстрого обнаружения возбудителей туберкулза в клинических образцах с помощью ПЦР, который характеризовался бы одновременно высокой специфичностью и чувствительностью, представляется на сегодняшний день актуальной задачей. Целью настоящего исследования являлась разработка быстрого, информативного, высокоспецифичного и высокочувствительного метода выявления геномной ДНК возбудителей туберкулеза в клинических образцах,.