Самоинактивация цитохромов Р450 при химическом восстановлении и в процессе катализа

• Автор: Карузина, Ирина Ивановна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 73 с. : ил.; 21х15 см

1. САМОИНАКТИВАЦИЯ РАСТВОРИМЫХ ИЗОЛИРОВАННЫХ ЦИТОХРОМОЙ Р0 ПРИ ХИМИЧЕСКОМ ВОССТАНОВЛЕНИИ
1.1. Сравнительное исследование скорости инактивации восстановленных дитионитом натрия карбохсихомплексов изолированных шпсросомальных и бактериальных цитохромов Р0

1.2. Влияние фосфолипидов на инактивацию цитохромов РВ4 н Р0лин

1.3. Кинетические характеристики реакции инактивации .

2. ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ ИНАКТИВАЦИИ ВОССТАНОВЛЕННЫХ ЦИТОХРОМОВ РВ4 И Р0ЛИН В ПРОЦЕССЕ АВТООКИСЛЕНИЯ .

2.1. Влияние окиси углерода и анаэробных условий за процесс инактивации.

2.2. Исследование инактивации цитохромов РВ4 и Р0лин в присутствии каталазы,

супероксндписмутазы СОД, ЭДТА и антиоксидантов

. Исследование влияния аминокислот и содержащнх соединений на скорость инактивации.

3. ИНАКТИВАЦИЯ ЦИТОХРОМА Р0 В МОНООКСИГЕНАЗНЫХ РЕАКЦИЯХ В МИКРОСОМАХ 3.1 .НАДФН гашцшфуемая инактивация цнтохрома РВ4 в реакциях гидрокевлнроваиия

субстратов 1го н Пго типов в микросомах печени кроликов, получавших фенобарбитал

3.2. Сравнительное исследование скоростей инактивации различных форм цнтохрома Р0 в
микросомах печени крыс .
3. Выяснение роли перекиси водорода, образующейся в активном центре цнтохрома Р0 и вне сто, в инактивации гемопротеина. .
3.3.1. Сравнение скоростей нншегнващш цнтохрома Р0 в НАДФНоксадазной и глюкозоокевдазной системах
3.3.2. Влияние перекиси водорода, добавленной извне, на скорость киакгнвааии цитохрома Р0 в моиоохеигеиазных реакциях .
3.3.3.Выяснение роли перекиси водорода, образующейся в активном центре цитохрома Р0 прямым и непрямым путем, в инактивации гсмопротсииа
3.3.4. Влияние хелаторов железа на инактивацию цггохрома Р0 и перекисное окисление лгашдовЗО
4. ИЗБИРАТЕЛЬНОСТЬ ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ ИНАКТИВАЦИИ ЦИТОХРОМА Р0 В МИКРОСОМАЛЬНОЙ МЕМБРАНЕ
5. ИНАКТИВАЦИЯ РАСТВОРИМОГО, ИЗОЛИРОВАННОГ О ЦИТОХРОМА РВ4 ПОД ДЕЙСТВИЕМ ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА
6. ОКИСЛИТЕЛЬНАЯ САМОИНАКТИВАЦИЯ ЦИТОХРОМА РВ4 В МОНООКСИГБНАЗНОЙ РЕКОНСТРУИРОВАННОЙ СИСТЕМЕ .
6.1. Сравнительное исследование скорости инактивации цитохрома РВ4 в при различном молярном отношении гемопротенна и НАДФНспецифнчаого флавопротеина
6.2.Инакгавация цнтохрома РВ4 в присутствии цнтохрома Ъ .
6.3. Влияние каталазы на скорость инактивации щггохрома РВ4
7. МОДИФИКАЦИЯ ГЕМА ЦИТОХРОМА РВ4 В ПРОЦЕССЕ ИНАКТИВАЦИИ .
8. ОКИСЛИТЕЛЬНАЯ МОДИФИКАЦИЯ АГЮФЕРМЕНТА ЦИТОХРОМА РВ4
доследование агрегатного состояния . .
У улевевяе физикохимических свойств цнтохрома РВ4 в процессе инактивации
М .фикация групп
Ii сяаввяе межмолекулярных ковалентных сшивок я роль iидроксшгьных радикалов в этом
. I. . .
АНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ ДОСТУПНОСТИ НАТИВНОГО И
Щ РВАННОГО ЦНТОХРОМА Р0 2В4.
т .ж .
.ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ. .
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность


Дополнительным стимулом к изучению цитохрома Р0 послужили работы, в которых было показано, что некоторые ферменты способны инактивироваться в каталитическом цикле под действием активных форм кислорода, таких как суперокисные, гидроксильные радикалы, перекись водорода, которые являются продуктами или косубстратами реакций , i, ivi, . Эти ферменты, обнаруженные в последнее время, привлекают к себе все более пристальное внимание исследователей, так как их существование открывает перед биохимиками новые перспективы для выяснения регулирующей роли кислородных радикалов в механизме как распада белков, так и возникновения многих патологических процессов в организме. К числу таких ферментов можно отнести и цитохром Р0, который обладает уникальной способностью, наряду с основными продуктами реакции, генерировать активные формы кислорода в процессе катализа в результате разобщения монооксигеназного цикла. Цитохром Р0 микросом печени, в отличии от других монооксигеназ и бактериального цитохрома Р0, не окисляет яи один из известных субстратов с полным сопряжением, и часть редоксэквивалентов расходуется в сопутствующих оксидазных реакциях. Продукты неполного восстановления кислорода , перекись водорода, ОН, образующиеся при распаде оксии пероксикомплексов цитохрома Р0, могут быть вовлечены в инактивацию цитохрома Р0. Самоипакгивация цитохрома Р0 в монооксигеназных реакциях и роль этой реакции в физиология и патологии клетки до конца не выяснены. В то же время достаточно подробно исследован механизм самоинакгнвации фермента в реакциях окисления суицидных субстратов активными метаболитами, в основе которого лежит ковалентная модификация гема, реже апофермента. Успехи в исследовании суицидной инактивации цитохрома Р0 позволяют сосредоточить внимание на синтезе ферментселективных субстратов, которые в процессе катализа могут превращаться в соединения с направленным терапевтическим, инсектицидным и гербицидным действием. Возросший в последние годы интерес исследователей к выяснению молекулярных механизмов реакций окислительной модификации белков и ферментов обусловлен тем, что эта реакция может быть начальной и универсальной стадией механизма деградации макромолекул в клетке. Эта изменения могут служить сигналом для узнавания эндогенными протеазами модифицированных белков. Ускоренная протеолитичсская деградация является физикохимической основой процессов обновления белков, старения и возникновения ряда патологических состояний В организме. У у . Выяснение механизмов окислительной модификации цитохрома Р0 в ходе его самоинактивации в монооксигеназных реакциях позволит получить дополнительную информацию о механизмах, лежащих в основе регуляция распада белков в клетке. С другой стороны, важность исследования механизма этой реакции состоит и в том, что многие лекарственные средства, являясь субстратами для цитохрома Р0, способны вызывать его самоинактивацию и приводить, таким образом, к нарушению детоксицирующей функции монооксигеназной системы печени. Следствием этого может быть изменение скорости и путей метаболизма лекарственных препаратов и других ксенобиотиков, поступающих извне в организм. Кроме того, активные формы кислорода, 1енерируемые цитохромом Р0 в процессе катализа, могут модифицировать не только фермент, но и другие макромолекулы клетки, что может стимулировать опухолевой рост и приводить к мутагенным, аллергенным и другим токсическим эффектам. Таким образом, выяснение механизмов окислительной самоинактивации цитохрома Р0, как одной из начальных стадий его деградации имеет важное значение для познания закономерностей деградации белков в клетке. Целью настоящей работы являлось 1 исследование механизмов инактивации цитохрома Р0 в процессе автоокисления в условиях химического восстановления и в ходе катализа в НАДФНзависимых частично сопряженных монооксигеназных реакциях 2 выяснение особенностей модификации гема и апофермента цитохрома РВ4 в процессе окислительной инактивации в монооксигеназной реконструированной системе. ЧГ . Уд Л , , ,п у.