Состояние обмена мембранных липидов в клетках соединительной ткани при системной склеродермии

• Автор: Комлева, Алла Валентиновна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 99 с. : ил.

1.1. Нарушение продукции компонентов внеклеточного матрикса

1.2. Факторы, влияющие на функции фибробластов.

1.3. Нарушения свойств мембран фибробластов при склеродермии.

Глава 2. Состав мембранных липидов фибробластов человека.

2.1. Фосфолипиды культивируемых фибробластов человека

2.2. Гликосфинголипидный состав фибробластов.

Глава 3. Метаболизм гликосфинголипидов ц. клетке.

3.1. Ферменты биосинтеза.Г

3.2. Нарушения состава и биосинтеза гликосфинголипидов.

3.3. Регуляция биосинтеза

3.4. Деградация гликосфинголипидов в клетке

Глава 4. Биологические функции гликосфинголипидов
4.1. Связывание экзогенных ганглиозидов с клетками.
4.2. Регуляция клеточного роста гликосфинголипидами
4.3. Взаимодействие с фибронектином и участие в процессах
клеточной адгезии
Заключение.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1. Материалы
1.1. Клеточные культуры
1.2. Кровь
1.3. Растворители.
1.4. Адсорбенты для жидкостной и тонкослойной хроматографии
1.5. Реагенты для обнаружения и идентификации веществ.
1.6. Стандартные липиды.
1.7. Факторы роста
1.8. Ну кл еоти дсахара
2. Методы исследований
2.1. Техника культивирования
2.2. Выделение липидов
2.3. Аналитические методы
2.3.1. Определение фосфора но микрометоду Васьковского.
2.3.2. Определение общего холестерина с помощью реактива i i
2.3.3. Определение сфингозина
2.3.4. Определение сиаловых кислот.
2.3.5. Определение белка.
2.4. Определение жирнокислотного состава фосфолипидов фибробластов.
2.5. Включение жирных кислот в фосфолипиды фибробластов.
2.6. Анализ 3 нейраминидазной активности
2.7. Анализ а2,3лактозилцерамидсиалилтрансферазной активности
2.8. Иммунофлюоресцентная микроскопия.
2.9. Изучение биологических эффектов ганглиозидов
2.9.1. Исследование связывания экзогенных ганглиозидов с мембраной фибробластов.
2.9.2. Изучение эффектов трансформирующего и тромбоцитарного факторов роста на пролиферацию фибробластов и участия ганглиозидов в клеточном ответе на ростовую стимуляцию.
2.9.3. Определение влияния ганглиозидов на продукцию сульфатированных гликозаминогликанов фибробластами.
2 Определение уровня ганглиозидов в лейкоцитах и сыворотке крови больных системной склеродермией
. Выделение лейкоцитов.
. Определение липидносвязанной сиаловой кислоты
в лейкоцитах
. Получение сыворотки крови
. Определение липидносвязанной сиаловой кислоты в
сыворотке крови
3. Статистическая обработка результатов
РЕЗУЛЬТАТЫ.
I. Фосфолипиды
1.1. Определение содержания фосфолипидов и холестерина в
культивируемых фибробластах кожи.
1.2. Определение уровня фосфолипидов на разных стадиях
культивирования клеток.
1.3. Включение олеиновой и пальмитиновой жирных кислот в
фосфолипиды культивируемых фибробластов
1.4. Жирнокислотный состав фосфолипидов фибробластов.
2. Определение содержания нейтральных гликосфинголипидов и ганглиозидов в культивируемых фибробластах кожи
2.1. Нейтральные гликосфинголипиды
2.2. Ганглиозиды
2.3. Исследование экспрессии ганглиозидных детерминант на клеточной поверхности фибробластов.
3. Определение активности ферментов метаболизма ганглиозидов
3.1. ОМЗнейраминидазная активность.
3.2. Активность а2,3лактозилцерамидсиалилтрансферазы.
4. Биологические эффекты экзогенных ганглиозидов
4.1. Связывание экзогенных ганглиозидов с фибробластами.
4.2. Изучение влияния ганглиозидов на пролиферацию фибробластов, стимулированную факторами роста
4.2.1. Эффекты тромбоцитарного и трансформирующего факторов роста
на пролиферацию фибробластов
4.2.2. Влияние ганглиозидов на ростовую стимуляцию фибробластов здоровых людей и больных системной склеродермией
4.3. Определение влияния ганглиозидов на продукцию сульфати
рованных гликозаминогликанов фибробластами
5. Определение содержания ганглиозидов в лейкоцитах и сыворотке крови
5.1. Оценка общего содержания ганглиозидов в лейкоцитах.
5.2. Определение липидносвязанных сиаловых кислот в сыворотке крови.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
1. Изменение содержания фосфолипидов
2. Изменения в составе и метаболизме гликосфинголипидов.
3. Биологические эффекты экзогенных ганглиозидов
4. Системный характер изменения гликосфинголипидного состава
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
БСА бычий сывороточный альбумин
ВЭТСХ высокоэффективная тонкослойная хроматография
ГСЛ гликосфинголипиды
сГАГ сульфагированные гликозаминогликаны
ССД системная склеродермия
СТ сиалилтрансфераза
ТСХ тонкослойная хроматография
ФЛ фосфолипиды
РБСБ фактор роста тромбоцитов
ЮБр трансформирующий фактор роста
ВВЕДЕНИЕ


Связывание экзогенных ганглиозидов с клетками. Заключение. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Растворители. Реагенты для обнаружения и идентификации веществ. Стандартные липиды. Определение фосфора но микрометоду Васьковского. Определение сиаловых кислот. Определение белка. Определение жирнокислотного состава фосфолипидов фибробластов. Включение жирных кислот в фосфолипиды фибробластов. Иммунофлюоресцентная микроскопия. Исследование связывания экзогенных ганглиозидов с мембраной фибробластов. Изучение эффектов трансформирующего и тромбоцитарного факторов роста на пролиферацию фибробластов и участия ганглиозидов в клеточном ответе на ростовую стимуляцию. Определение влияния ганглиозидов на продукцию сульфатированных гликозаминогликанов фибробластами. Выделение лейкоцитов. РЕЗУЛЬТАТЫ. Жирнокислотный состав фосфолипидов фибробластов. Исследование экспрессии ганглиозидных детерминант на клеточной поверхности фибробластов. ОМЗнейраминидазная активность. Активность а2,3лактозилцерамидсиалилтрансферазы. Связывание экзогенных ганглиозидов с фибробластами. Оценка общего содержания ганглиозидов в лейкоцитах. Определение липидносвязанных сиаловых кислот в сыворотке крови. Изменения в составе и метаболизме гликосфинголипидов. Системная склеродермия ССД заболевание соединительной ткани, сопровождаемое генерализованным фиброзом. Выделяют три основных направления развития патологического процесса 1 повреждение эндотелия сосудов 2 иммунологические сдвиги 3 нарушения продукции компонентов внеклеточного матрикса клетками соединительной ткани. При изучении патогенеза ССД на клеточном уровне было установлено вовлечение в патологический процесс таких клеток, как фибробласты, эндотелиальные клетки, тромбоциты, лимфоциты, моноциты и тучные клетки . Широко используемой моделью для исследования механизмов развития фиброза являются монослойные культуры фибробластов, полученные из биоптатов кожи больных системной склеродермией. Главной особенностью такой модели является то, что показатели обмена и функциональные особенности клеток могут быть изучены в отсутствие влияния на них других категорий клеток иили нейрогуморальных факторов регуляции. К настоящему времени установлено, что фибробласты кожи больных ССД в культуре продуцируют больше коллагена, гликозаминогликанов комплексных полисахаридов прогеогликанов и фибронектина, чем фибробласты кожи здоровых людей , , , , 9. Повышенный синтез компонентов внеклеточного матрикса сохраняется i vi в течение ряда клеточных генераций 4, , 9. При этом у склеродермических фибробластов i vi значительно снижена чувствительность к внешним факторам регуляции клеточного роста и биосинтеза, и, в отличие от клеток здоровых людей, они осуществляют аутокринную ростовую и секреторную стимуляцию , , 3. Изменены также адгезионные свойства этих клеток . Исследования культивируемых фибробластов кожи больных ССД, проведенные в лаборатории патофизиологии соединительной ткани Института ревматологии РАМН показали, что для данных клеток характерно повышение транспорта ионов кальция через клеточную мембрану и аномальное функционирование аденилатциклазной системы . Эти наблюдения могут свидетельствовать о нарушениях свойств мембран склеродермических фибробластов и позволяют предположить изменение состава основных мембранных липидов и компонентов гликокаликса при ССД. Липидный состав фибробластов кожи больных системной склеродермией или другими заболеваниями соединительной ткани ранее не изучался. Вместе с тем в настоящее время получено большое число доказательств того, что липидный состав в значительной мере определяет функционирование рецепторных и фане портных систем клетки, адгезионные и антигенные свойства клеточной поверхности. Все сказанное свидетельствует о важности изучения состава и структуры липидов клеток больных ССД, а также установления роли этих мембранных компонентов в развитии фиброза при данном заболевании. Определить состав и содержание фосфолипидов, холестерина, гликосфинголипидов в фибробластах кожи больных системной склеродермией.