Программируемая клеточная смерть Saccharomyces cerevisiae, вызванная феромоном

• Автор: Кнорре, Дмитрий Алексеевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 136 с. : 21 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Феномен программируемой клеточной смерти.

Характерные признаки апоптоза.

Функции апоптоза у многоклеточных.

Компоненты каскада самоубийства.

Роль митохондрий в апоптозе многоклеточных

Терминология типов клеточной смерти.

Апоптотические домены и механизмы апоптоза в разных

систематических группах.

Глава 2. Запрограммированная гибель одноклеточных
организмов
Инфузории.
Паразитиеские кинетопластиды
Слизевики.
Одноклеточные автотрофы.
Архемонады
Глава 3. Молекулярные механизмы программируемой клеточной
смерти дрожжей
Дрожжевая метакаспаза.
Протеаза От
Роль митохондрий в программируемой клеточной смерти
дрожжей.
Неспецифическая митохондриальная пора дрожжей.
Глава 4. Феромонный каскад дрожжей
Биология дрожжей
Клеточный ответ на половой феромон.л
Гибель клеток Б. сегеумае, вызванная афактором
Глава 5. Кальций в дрожжах
Методы измерения внутриклеточного кальция в . vii
Поддержание кальциевого гомеостаза в . vii.
Амиодарон
Глава 6. Особенности митохондрий пекарских дрожжей.
Глава 7. Активные формы кислорода
Особенности образования и детоксикации АФК у дрожжей
. vii
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 1. Культивирование дрожжей.
Генотипы использованных штаммов дрожжей
Приготовление среды для культивации
Условия культивации
Глава 2. Тесты на выживание дрожжей
Индукция ПКС.
Оценка выживаемости по количеству КОЕ
Микроскопические методы
Глава 3. Синхронизация культуры дрожжей
Глава 4. Методы флуоресцентной микроскопии.
Окрашивание клеток на АФК
Окрашивание клеток на митохондрии
Окрашивание клеток на Са2.
Окрашивание клеток на ДНЮ
Определение репликативного возраста клеток.
Глава 5. Выделение митохондрий из vii и
измерение скорости поглощения кислорода
Глава 6. Молекулярно биологические методы
Выделение плазм ид ной ДНК из .i
на колонках i ii i.
Выделение геномной ДНК дрожжей.
Расщепление и лигирование ДНК дрожжей
Аналитический электрофорез ДНК в агарозных гелях
Трансформация клеток Е.соЧ методом электропорации.
Интегративная трансформация дрожжей.
Получение мутантных линий с полностью
инактивированным геном
Глава 7. Список использованных реактивов
РЕЗУЛЬТАТЫ
Глава 1. Исследование модели программируемой клеточной смерти дрожжей штамма 31, вызванной избытком
феромона
Глава 2. Исследование ПКС, индуцированный высокой концентрацией
феромона на линии клеток 31 16.
Глава 3. Влияние ингибиторов и антиоксидантов на ПКС клеток 3
1В 16.
Глава 4. Скрининг генов, участвующих в регуляции программы самоубийства vii, вызванного избытком
фермона.
Описание скрининга
Результаты скрининга
Анализ мутантов на предмет устойчивости к ПКС, вызванной
избытком феромона.
Глава 5 Индукция программируемой клеточной смерти на
промежуточных этапах.
Индукция ПКС пекарских дрожжей
перекисью водорода и менадионом
Искусственное повышение концентрации цитоплазматического
кальция
Амиодарон
Глава 6. Характерные признаки апоптоза, наблюдаемые в клетках обработанных амиодароном.
Глава 7. Гиперполяризация митохондрий, вызванная
амиодароном.
Изменения дыхания дрожжевых клеток, вызванные амиодароном.
Глава 8. Образование АФК клетками, вызванное амиодароном
Глава 9. Фрагментация митохондрий.
Глава . Исследование функции гена УР1
ОБСУЖДЕНИЕ
Список работ, опубликованных по теме диссертации
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


АФК, сморщивание i цитоплазматической мембраны, уменьшение объема клетки, разрывы нитей ядерной ДНК в межнуклеосомальных участках, конденсация хроматина по периферии ядра, последующий распад ядра на части, фрагментация клеток на визикулы с внутриклеточным содержимом апоптотические тельца. В отличие от некроза, в случае апоптоза целостность цитоплазматической мембраны сохраняется до поздних стадий процесса. Кроме того, в большинстве случаев процесс апоптоза, в отличие от некроза, зависит от уровня АТФ в клетке vii . i . Самуилов и др. v, . Однако четко разграничить апоптоз и некроз довольно трудно, поскольку, с одной стороны, были описаны типы программируемой клеточной смерти, протекающие без проявления ряда характерных для апоптоза признаков, например апоптоз без выхода цитохрома с . i . На , . Кроме этого, в экспериментальных условиях, процесс гибели клеток может начинаться с признаками апоптоза, но в последствие заканчиваться некротической гибелью. Все это послужило поводом для введения различными авторами терминов, таких как параапоптоз, апонекроз и другие. Для того, чтобы избежать возможных противоречий при использовании этих терминов, ниже мы попробуем систематизировать современную терминологию способов клеточной гибели. Как уже было сказано выше, ПКС была обнаружена и интенсивно изучалась в клетках высших эукариот. До недавнего времени считалось, что ПКС свойственно исключительно многоклеточным, поэтому сложилась необычная ситуация, заключающаяся в том, что механизмы апоптоза достаточно хорошо изучены в многоклеточных и не изучены в модельных одноклеточных организмах, таких как дрожжи. Поэтому мы вынуждены рассматривать общие закономерности апоптотического каскада на основании данных, полученных для клеток млекопитающих. Рассмотрим последовательность событий в апоптотическом каскаде животных клеток. Первым этапом является инициация апоптоза, которая может происходить как за счет внешних стимулов, например, связывания фактора некроза опухоли с рецептором, так и за счет внутренних, таких как нарушение ядерной ДНК, приводящее к активации белка р, или увеличение интенсивности образования АФК митохондриями цит. v, . После этого идет принятие решения клеткой, активировать каскад самоубийства или нет. В случае с внутренним сигналом, прежде чем начать необратимое саморазрушение, клетка обычно пытается устранить причину появления этого сигнала. Так, в случае слабого повреждения ДНК, белок р сначала индуцирует репарацию и только если эти попытки оказываются недостаточно эффективными, вызывает остановку клеточного цикла и апоптоз см . Если часть митохондрий интенсивно образуют АФК, опасные для клетки, то клетка сначала запускается механизм элиминации отдельных митохондрий и только потом, в случае неудачи, инициирует собственное самоубийство см Скулачев . Следующим этапом идет амплификация сигнала. При апоптозе быстрая скорость осуществления программы достигается с помощью каскада ферментов, специфически активирующих друг друга и создающих петли положительной обратной связи. Примером такой петли может служить инактивация каспазой3 белка Вс12, который ингибирует выход из митохондрий цитохрома с, инициирующего цепь событий, приводящую к активации каспазы3 i . Заключительным этапом программы апоптоза является гидролиз компонентов клетки с помощью неспецифических протеаз и нуклеаз. Зачем многоклеточным организмам нужно контролируемое уничтожение отдельных клеток Участие в онтогенезе. В ходе развития, часть клеток становится ненужной, и алоптоз считается экономичным, быстрым и аккуратным способом их элиминирования. Так, например, происходит рассасывание хвоста у головастика ii . . Поддержание тканевого гомеостаза. Так в крови большинство новообразованных нейтрофилов гибнет в течении нескольких дней, не выполняя при этом никаких функций. Поддержание такого футильного цикла необходимо для быстрой мобилизации большого количества иммунных клеток в случае распространения инфекции см. . Защита от распространения вирусов. Примером здесь может служить программируемая клеточная смерть гиперчувствительный ответ у растений, инфицированных вирусом табачной мозаики см. Ванюшин, .