Получение, свойства и применение ДНК-содержащей нанопленки для пьезокварцевых биосенсоров

• Автор: Фахруллин, Равиль Фаридович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 170 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Антитела к нативной ДНК как критерий диагностики аутоиммунных заболеваний

1.2. Наногравиметрические биосенсоры как инструмент биохимических исследований

1.2.1. Биосенсоры на основе пьезокварцевых резонаторов

1.2.2. Физические основы массчувствительности

пьезокварцевых резонаторов

1.2.3. Конструирование пьезокварцевого биосенсора

1.2.4. Иммобилизация биологического компонента биосенсора

1.3. Методы формирования и изучения свойств ДНКсодержащих рецепторных покрытий биосенсоров

1.3.1. Ковалентные методы иммобилизации нуклеиновых кислот

1.3.2. Нековалентные методы иммобилизации нуклеиновых кислот
1.3.3. Бионанотехнологические подходы к иммобилизации нуклеиновых кислот
1.3.4. Атомносиловая микроскопия как инструмент для изучения биологических объектов
1.4. Заключение по обзору литературы
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Оборудование и реактивы
2.2. Объекты исследований
2.3. Кварцевые микровесы устройство и применение
2.3.1. Кварцевые микровесы для анализа в газовом режиме
2.3.2. Кварцевые микровесы ОСМ 0
2.4. Проточноинжекццоный режим исследования
2.4.1. Дегазация растворов
2.4.2. Термостатирование
2.4.3. Установка проточной ячейки
2.4.4. Перистальтический нанос и система трубок
2.5. Предварительная обработка и очистка электродов ПКР
2.6. Нанесение биологических пленок на электрод ПКР
2.7. Определение слояпредшественника для иммобилизации ДНК
2.8. Формирование полиЬлизинового слояпредшественника
2.8.1. Определение оптимального значения
2.8.2. Определение оптимального значения температуры
2.8.3. Определение оптимального времени инкубации
2.8.4. Определение оптимальной концентрации полиЬлизина
2.8.5. Зависимость формирования полиЬлизинового слояпредшественника от материала и обработки поверхности электрода ПКР
2.9. Визуализация поверхности электродов кварцевых резонаторов методом атомносиловой микроскопии
2 Формирование ДНКсодержащей пленки
. Определение чистоты и однородности препарата нативной ДНК
. Определение буферного раствора
. Определение оптимальной концентрации ДНК
. Определение оптимального значения температуры
2 Характеристика формирования и свойства ДНКсодержащей пленки
. Изучение взаимодействия иммобилизиованного поли лизина и ДНК i i
. Кинетика связывания полиЬлизина и ДНК
. Определение вязкостноэластичных свойств ДНКсодержащей нанопленки
2 Визуализация поверхности ДНКсодержащей нанопленки методом атомносиловой микроскопии
. Предварительная обработка золотых подложек
. Приготовление проб для исследования
. Визуализация наноструктурированных поверхностей с помощью АСМ
. Обработка АСМизображений
2 Применение ДНКсодержащей нанопленки в качестве чувствительного слоя пьезокварцевого биосенсора
. Блокировка сайтов неспецифического связывания
. Иммуноанализ
2 Оценка результатов и статистическая обработка
. Пьезокварцевая массчувствительность в газовой среде
. Пьезокварцевая массчувствительность в жидкой среде
. Статистическая обработка результатов ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Определение и формирование слояпредшественника для иммобилизации нативной ДНК
3.1.1. Слойпредшественник для иммобилизации ДНК
3.1.2. Формирование полиЬлизинового слояпредшественника на серебряных электродах в газовом режиме
3.1.3. Определение характера формирования полиЬлизинового слоя в зависимости от материала и обработки электродов ПКР
3.1.4. Формирование полиЬлизинового слояпредшественника на золотых электродах в газовом режиме
3.1.5. Регенерация электродов ПКР для последующего их использования
3.2. Формирование и характеристика ДНКсодержащей пленки
3.2.1. Определение чистоты и однородности нативной ДНК
3.2.2. Определение буферного раствора для иммобилизации ДНК
3.2.3. Определение оптимальной концентрации ДНК
3.2.4. Определение оптимальной температуры присоединения ДНК
3.2.5. Изучение взаимодействия иммобилизованного полилизина и ДНК i i в проточноинжекционном режиме
3.2.6. Влияние молекулярной массы полиЬлизина на связывание нативной ДНК
3.2.7. Кинетика связывания нативной ДНК с иммобилизованным полиЬлизином
3.2.8. Изучение структуры ДНКсодержащей пленки методом атомносиловой микроскопии
3.3. Иммуноанализ при помощи ДНКбиосенсора на основе ДНКсодержащей нанопленки
3.3.1 Иммуноанализ в газовом режиме
3.3.2. Иммуноанализ в жидкостном режиме ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ВЫВОДЫ ЛИТЕРАТУРА
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
атомносиловая микроскопия
АТ антитело
АГ антиген
БА бронхиальная астма
БСА бычий сывороточный альбумин
дДНК денатурированная дезоксирибонуклеиновая кислота
нДНК нативная дезоксирибонуклеиновая кислота
НК нуклеиновая кислота
ММ молекулярная масса
ИКР пьезоэлектрический кварцевый резонатор
ПНР поверхностный плазмонный резонанс
РНК рибонуклеиновая кислота
СКВ системная красная волчанка
СП степень полимеризации
ТСБ Триссолевой буфер
ФСБ фосфатносолевой буфер
ФСБТ фосфатносолевой буфер с твином
ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота
додецилсульфат натрия
I иммуноглобулин
i англ. кварцевые микровесы
сдвиг резонансной частоты колебаний кварцевого резонатора сдвиг реактивного сопротивления кварцевого резонатора
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


АТ к нДНК, присутствующие в крови больных СКВ и другими аутоиммунными заболеваниями, представлены иммуноглобулинами классов и М. АТ к ДНК класса I обладают перекрестной активностью к различным антигенам, как собственным, так и экзогенным. Связывание таких АТ с нуклеиновыми кислотами имеет, как правило, низкоаффинный характер. В отличие от них, АТ к ДНК класса I обладают высоким сродством к ДНК и не характеризуются связывающей активностью в отношении неродственных антигенов , . Среди АТ к ДНК класса I выделяют три группы иммуноглобулинов АТ к нативной ДНК нДНК, антитела к денатурированной ДНК дДНК и антитела, реагирующие как с нДНК, так и с дДНК. АТ к дДНК обладают сродством ко всем компонентам денатурированной ДНК основаниям, нуклеотидам, нуклеозидам и сахарофосфатному остову, тогда как АТ к нДНК реагируют с дезоксирибофосфатным остовом и комплементарными парами оснований i . У большинства больных системной красной волчанкой повышен уровень содержания в крови именно АТ к нДНК, что приводит к образованию циркулирующих иммунных комплексов и способствует разрушению тканей и органов, например, почек. При этом уровень содержания коррелирует со степенью тяжести заболевания у большинства пациентов , . Помимо этого, увеличение уровня содержания АТ к нДНК рассматривают как признак других аутоиммунных, инфекционных и онкологических заболеваний , . Для своевременного выявления и определения курса лечения подобных заболеваний крайне важно достоверно и оперативно определить уровень содержания антител к нДНК , . Однако сложность заключается в том, что на сегодняшний день не существует единой, общепринятой методики определения уровня АТ к нДНК. ДНК, используемые в лабораторной диагностике, включают в себя радиоиммунные, иммунофлуоресцентные и иммуноферментные методы анализа. Радиоиммунный метод анализа заключается в совместной инкубации меченой радиоактивной нДНК и сыворотки крови пациента с последующей преципитацией иммунных комплексов в сульфате аммония. Данный метод считается наиболее чувствительным из существующих, но использование радиоактивных меток значительно затрудняет процесс диагностики. Кроме того, одним из недостатков данного метода является возможность параллельного определения АТ к дДНК изза загрязнения образцов антигенов денатурированной ДНК. Флуоресцентный иммуноанализ метод непрямой флуоресценции использует в качестве субстрата для связывания антител к нДНК меченый кинетопласт простейшего iii ii , , . Это позволяет избежать побочного определения АТ к дДНК, так как кинетопласт iii ii представляет собой кольцевую молекулу нативной ДНК. Тем не менее, метод непрямой флуоресценции трудоемок и длителен, требует специальной подготовки персонала, что является лимитирующим фактором для широкого применения данного метода в лабораторной практике. Иммуноферментный анализ ИФА предполагает иммобилизацию ДНК на поверхности лунок пластиковых планшетов, инкубацию в них сывороток, нанесение вторых антител, меченых тем или иным ферментом, внесение субстрата ферментативной реакции, инкубацию, внесение стопреагента и оценку анализа в результате изменения окраски раствора в лунках. В настоящее время ИФА используется как основной лабораторный метод определения антител к нДНК. Однако и ИФА не всегда позволяет достоверно дифференцировать норму от патологии. Это связано, в первую очередь, с многостадийным характером анализа. Каждая из стадий вносит существенный вклад в суммарную ошибку анализа, что часто приводит к ложноположительным или ложноотрицательным результатам. Ведутся многочисленные работы, направленные на усовершенствование иммуноферментного определения уровня содержания АТ к нДНК. Основное внимание при усовершенствовании иммуноферментных методов уделяется иммобилизации антигена нДНК . Например, описан амперометрический биосенсор, основанный на включенной в нитроцеллюлозную мембрану нативной ДНК и позволяющий определять повышенный уровень антител к ДНК i . Таким образом, сохраняется многостадийный характер анализа. В связи с этим возникает необходимость в поиске других подходов к созданию метода прямой детекции АТ к нДНК.