Разработка метода иммобилизации белков в микрочипах для иммуноферментного анализа

• Автор: Авсеенко, Наталья Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 158 с. : ил

1. Синтез вещества на микроматрице

2. Методы нанесения вещества на микрочипы.

2.1. Последовательные методы.

2.2. Параллельные методы

II. Электронаиыление. Различные применения и подробное описание метода.

1. Применение электронапыления для изготовления тонких источников

радиоактивности.

2. Применение электрораспыления в массспсктрометрии

2.1. Явление электрораспыления. Теория метода

3. Сохраняют ли молекулы нативное состояние при электрораспылении

4. Применение электрораспыления для изучения третичной структуры

белковых ионов в газовой фазе.
5. Применение электронапыления в изготовлении образцов для туннельной
микроскопии.
6. Другие известные применения явления электрораспыления
7. Применение электронапыления для изготовления микрочипов
III. Методы иммобилизации белков на микрочипах
1. Адсорбция
2. Химическое привязывание
2.1. Пришивание глутаровым альдегидом
2.2. Ковалентная пришивка через производные силана.
2.3. Пришивка белков к поверхности золота через тиоловые группы
2.4. Декстрановые спейсоры для пришивки белков и способы их
активации.
2.5. Пришивка белков через ИНгконцевые гистидины СН1в1а к
никилированному стеклу
3. Иммобилизация в пористых средах
3.1. Иммобилизация белков на фильтрах
3.2. Иммобилизация белков в ПААГ.
IV. Анализ методов регистрации в иммунохимическом гетерогенном анализе.
2. ФИА
V. Конкретные примеры изготовления и применения белковых микрочипов
VI. Заключение и постановка задачи.
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
I. Материалы.
1. Подложки для микроматриц.
2. Маски
3. Реагенты.
4. Белки
5. Растворы, использованные в работе
II. Методы.
1. Установка для электронапыления микрочипов
2. Изготовление маски из слюды
3. Предварительная очистка алюминиевой поверхности обработкой в высокочастотном газовом разряде
4. Описание различных модификаций алюминиевой поверхности.
4.1. Адсорбция слоя инертного белка. ПАБ.
4.2. Адсорбция слоя инертного белка с последующей обработкой Глутаровым альдегидом. ПАБГА
4.3. Гидрофобизация поверхности Алюминия диметилдихлорсиланом ПАУДДС.
4.4. Покрытие алюминиевой поверхности слоем полиметилметакрилата ПАПММА
4.5. Обработка поверхности подложки окисленным декстраном.
ПАДекс
5. Подготовка белков к электронапылению.
6. Процедура электронапыления белковой микроматрицы.
7. Методики иммобилизации белка.
7.1. Иммобилизация белковых депозитов в парах глутарового альдегида. ПАГА
7.2. Иммобилизация из микрокапель белковосахарного раствора
7.3. Восстановление Шиффовых оснований для субстрата со слоем окисленного декстранаПАДекс.
8. Иммунизация мышей и изготовление иммунных сывороток
9. Стандартный ИФА в лунках.
. ИФА на микрочипах
.1. Описание приспособлений для проведения ИФА на микрочипах.
.2. ИФА с мышиными сыворотками,
.3. ИФА с человеческими сыворотками
.4. ИФА на монокомпонентных микрочипах.
И. ИФА на дисках
. Описание установки для регистрации ответа в ИФА флуоресценции и оптической плотности пятен.
. Учет фоновой освещенности при анализе чипов
ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ДИСКУССИЯ
I. Разработка способа иммобилизации белков в микроматрицах.
1. Выбор подложки для микроматриц
2. Способ иммобилизации элсктронапыленного сухого белка
3. Разработка технологии иммобилизации белков
3.1. Сравнение иммобилизационных технологий но уровню ответа в ИФА на дисках.
3.2. Сравнение иммобилизационных технологий по пределу чувствительности и сигналу в ИФА на микрочипах
3.3. Влияние смачиваемости модифицированных поверхностей на выбор технологии иммобилизации
3.4. Уровень фона как критерий выбора технологии иммобилизации
3.5. Наилучший метод иммобилизации белка
3.6. Выбор субстрата для щелочной фосфатазы.
II. Мультикомпонентные микроматрицы.
1. Изготовление сложных многокомпонентных микроматриц
2. Качественный анализ мышиных сывороток в ИФА на микрочипах
3. Качественное сравнение чувствительностей ИФА на микроматрицах с ИФА в стандартных луночных планшетах.
4. Анализ человеческой сыворотки на присутствие антител с использованием микрочипов.
5. Хранение микроматриц.
6. Количественное сравнение ИФА на микроматрицах с ИФА в стандартных луночных планшетах.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРУЕМЫХ РАБОТ.
Благодарности
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ


Цель данной работы состояла в разработке технологии иммобилизации белка на поверхности носителя, создании прототипов многокомпонентных микроматриц для иммунохимического анализа и проверке их работоспособности в модельной системе. ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. I. Методы изготовления микрочипов. Термины биочип ii, i, микроматрица i и микрочип ii широко распространены в современной научной литературе. В широком смысле биочипами называют любые небольшие аналитические устройства, имеющие в себе компоненты биологического происхождения. Под микрочипом или микроматрицей понимают любой твердый субстрат, на поверхность которого нанесен упорядоченный рисунок чаще всего решетка микропятеи одного или нескольких биологических веществ. Именно это определение микроматрицы микрочипа и будет в дальнейшем использоваться в данной работе. Существующие подходы к изготовлению микрочипов можно разделить на две основные группы синтез вещества i i, прямо на микроматрице и нанесение вещества из готовых растворов. Синтез вещества на микроматрице. Метод изготовления олигонуклеотидных микрочипов путем синтеза веществ в микроточках на матрице был развит С. П. Фодором и его коллегами и успешно применяется фирмой ix ,,. Метод совмещает технологию фотолитографии, заимствованную из полупроводниковой индустрии, с химией ДНК синтеза. Реакция присоединения каждого нуклеотида к матрице активируется светом. Специальная светонепроницаемая маска используется для защиты поверхности в тех местах, где прохождение реакции в данный момент нежелательно. Основное преимущество данной технологии заключается в возможности перехода от нуклеотидных баз данных сразу к производству микрочипов, избегая необходимости предварительно синтезировать и хранить олигонуклеотиды. Этот подход также допускает одновременное производство множества микрочипов, что делает его подходящим для промышленного производства больших партий идентичных микрочипов. В настоящее время микрочипы, выпускаемые фирмой А1Туте1пх, содержат до 0 ООО точек олигонуклеотидов на площади 1. V конец 8. Однако у метода есть существенные недостатки и раничения. Предельная эффективность светоактивируемого синтеза . Это накладывает ограничения на длину синтезируемых олигонуклеотидов, которая не может практически превышать пар. Можно подсчитать, что при такой точности синтеза и длине синтезируемой последовательности более одиннадцати пар нуклеотидов более половины всех молекул будут содержать ошибки. Важно также отметить, что вся поверхность микрочипа соприкасается с растворами во время всех этапов синтеза, что увеличивает вероятность неспецифического связывания и повышает фон. К недостаткам метода также относятся его дороговизна, связанная, в частности, с необходимостью производства большого количества масок. Для присоединения одного нуклеотидного звена необходимо рассчитать и изготовить четыре маски, т. Однако очевидно, что переход от олигонуклеотидов к пептидам только усугубит вышеописанные недостатки данного метода. В связи с большим разнообразием белковых мономеров аминокислот потребуется делать в пять раз большее число масок, и циклов химических реакций в растворе и отмывок будет необходимо сделать для удлинения цепочки на одну аминокислоту, что существенно увеличит вероятность загрязнения поверхности матрицы и ошибок в синтезе. Таким образом, для белковых микрочипов более перспективным представляется нанесение на микроматрицу уже готовых белков. Методы нанесения вещества на микрочипы. Методы изготовления микроматриц, базирующиеся на нанесении ранее полученных и очищенных белков или пептидов, можно разделить на две основные группы последовательные методы, в которых микроточки белка наносятся на микрочип одна за другой и параллельные методы, в которых микроточки одного и того же белка наносятся на матрицу одновременно. Микрокоытактное нанесение или микропипетирование. Стэндфордского университета 0. Микродоза раствора наносится на поверхность при контакте пера иглы с подложкой микрочипа. Перемещения иглы контролируются компьютером. Белок наноситься в смеси с глицерином в условиях повышенной влажности, необходимой для предотвращения высыхания раствора на игле и в микрокаплях во время нанесения.