Полиморфизм генов цитохромов Р450 подсемейства 3А, прегнанового Х рецептора и вариабельность активности CYP3A

• Автор: Щепотина, Елена Георгиевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 137 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Цитохромы Р0 ЗА и их транскрипционный регулятор прегнановый X рецептор

1.1.1. Подсемейство цитохромов Р0 ЗА

1.1.1.1. Экспрессия цитохромов Р0 подсемейства ЗА в различных органах

1.1.1.2. Оценка метаболической активности СУРЗА

1.1.1.3. Геномная организация локуса СУРЗА

1.1.2. Прегнановый X рецептор

1.1.2.1. Внугриклегочная локализация РХИ. и экспрессия РХК в различных тканях

1.1.2.2. Структура и функциональные особенности белка РХК

1.1.2.3. Геномная организация прегнанового X рецептора

1.2. Регуляция СУРЗА
1.2.1. СУРЗА и транскрипционные факторы
1.2.1.1. Ингибирование и индукция СУРЗА
1.2.1.2. Регуляция конститутивной экспрессии СУРЗА
1.2.1.3. Коэкспрессия ядерных рецепторов и СУРЗА
1.2.2. Метилирование СУРЗА4 и ассоциация с количеством мРНК
1.2.3. Функционально активные альтернативносплайсированные варианты СУРЗА
1.2.4. Метаболическая активность СУРЗА и генетический полиморфизм СУРЗА и РХЯ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Объект исследования
2.2. Характеристика исследуемых вариантов генов СУРЗА4, СУРЗА5,
СУРЗА7, СУРЗА и РХЯ
2.2. МАТЕРИАЛЫ
2.2.1. Реактивы
2.2.2. Оборудование
2.3. МЕТОДЫ
2.3.1. Определение бргидроксикортизола и кортизола в моче
2.3.1.1. Жидкостная экстракция гормонов из мочи
2.3.1.2. Высокоэффективная жидкостная хроматография
2.3.1.3. Расчет концентраций гормонов и показателя активности СУРЗА
2.3.2. Выделение ДНК из периферической крови
2.3.3. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
изучаемых генов и олигонуклеотидных праймеров
2.3.4 Полимеразная цепная реакция
2.3.5 Электрофорез и идентификация продуктов ПЦР
2.3.6. Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов
2.3.7. Ферментативный гидролиз 1
2.3.8. Анализ продуктов ферментативного гидролиза
2.3.9. Анализ конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК СР
2.3 Окрашивание ДНК нитратом серебра
2.3 Подготовка фрагментов ДНК к секвенированию
2.3 Статистический анализ результатов исследования
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Распределение показателя активности СУРЗА в выборке детей от 1 года до лет и его возрастная динамика
3.2. Анализ полиморфизма СУРЗА4, СУРЗА5, СУРЗА7, СУРЗА и РХЯ
3.2.1. Оптимизация методов выявления аллельных вариантов
3.2.2. Частоты встречаемости аллелей и генотипов изученных полиморфных вариантов
3.3. Выявление ассоциаций между изученными полиморфными вариантами и активностью СУРЗА
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Не так давно выявлен вариант 2 белок которого . В гене 3 выявлены три полиморфных варианта, один их которых приводит к редуцированному белку за счет раннего стопкодона i . В последние годы оценка функциональных проявлений открываемых мутаций проводится i vi, если проводится вообще. В то же время, работы, посвященные изучению влияния генетических факторов на активность 3 у человека и лабораторных животных i viv, представлены не для всех полиморфных вариантов. Поэтому изучение активности 3 но эндогенным субстратам неинвазивными методами может привнести новые знания в понимание роли генетических факторов в формировании активности всего подсемейства. Причина вариабельности активности 3, возможно, кроется не только в изменениях нуклеотидных последовательностей генов подсемейства, но и в регуляции их транскрипционной . Поэтому комплексное изучение полиморфизма 3 и их геноврегуляторов, основным из которых является ген прегнанового X рецептора, может прояснить генетическую основу вариабельности ферментативной активности. Другим важным фактором изменения ферментативной активности 3 является возраст. Отличия метаболизма ксенобиотиков, обусловленные возрастом, наиболее отчетливо проявляются у новорожденных и лиц пожилого возраста. В литературе отсутствуют данные об изменении метаболической активности СУРЗА у детей в период с раннего детства до подросткового возраста. Поскольку ферментативная активность способна существенно изменяться в течение коротких отрезков онтогенеза, изучение возрастной динамики активности также может привести к идентификации важных факторов в регуляции СУРЗА. Многими исследователями для обнаружения и выявления мутаций используется метод секвенирования ДНК, который требует специального дорогостоящего оборудования и реактивов и не всегда доступен большинству лабораторий. Оценка конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК 8БСР позволяет обнаружить варианты последовательности гена, как новые, так и уже известные. Для выявления известных мутаций широко используют метод полиморфизма длины рестрикционных фрагментов ПДРФ. Несмотря на то, что полиморфизм СУРЗА изучается многими исследователями, для ряда полиморфных вариантов не предложены способы их детекции методами ПДРФ и БЭСР, а для изучения полиморфизма гена РХЯ нами не найдена информация об их использовании. Поэтому оптимизация методов ПДРФ и ББСР в изучении генов СУРЗА и РХР. Цель исследования изучение влияния полиморфизма генов СУРЗА4, СУРЗА5, СУРЗА7, СУРЗА, РХК на вариабельность активности СУРЗА. Изучить ферментативную активность СУРЗА по содержанию эндогенных кортизола и бргидроксикортизола в моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в возрастной период от 1 года до лет. Оптимизировать способы выявления полиморфных вариантов генов СУРЗА и РХИ методами полимеразной цепной реакции, полиморфизма длины рестрикционных фрагментов и конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК. Изучить частоту встречаемости полиморфных вариантов и мутаций генов СУРЗА4 1В, 2, 5, , т8ТСТ, СУРЗА5 ЗС, б, СУРЗА7 2, СУРЗА 1В, 2А и РХЯ СТ, с1сЮАСААС, с. СА, . Проанализировать ассоциации генотипов СУРЗА и РА7 с активностью СУРЗА. Научная новизна. Впервые изучено изменение активности СУРЗА, оцененной по бргидроксилированию кортизола, в возрастной период с 1 г. Впервые выявлено, что основной рост активности происходит в первые два с половиной года жизни, а после 5 лет темпы ее роста снижаются. Предложено выявлять полиморфные варианты и мутации СУРЗА4 , 2, 5, , СУРЗА5 ЗС, 6, СУРЗА7 2, СУРЗА 1В, 2А, РХК . СА, . СТ методом ПЦРПДРФ, вставку СУРЗА4 шбТОТ методом БЗСР и делению РХЯ с1еЮАСААС полимеразной цепной реакцией с дальнейшим разделением продуктов в полиакриламидном геле. СА, . СТ у европеоидов России. Впервые в России проведен анализ сравнения показателя активности СУРЗА, оцененного по бргидроксилированию кортизола, у носителей разных генотипов СУРЗА и РХЯ. В группе гетерозигот СУРЗААЗС среднее значение показателя активности СУРЗА в 3, раза выше относительно группы гомозигот СУРЗА5ЗСЗС р0,4.