Получение, термостабильность и структурные исследования формиатдегидрогеназ из различных источников

• Автор: Садыхов, Эльчин Гусейнгулу оглы
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 122 с. : ил.

Поэтому получение, изучение свойств и определение трехмерной структуры растительных ФДГ является исключительно актуальной научной задачей. В работе в качестве объектов исследования были использованы рекомбинантные ФДГ из бактерий . РБеФДГ и x . МогФДГ, метилотрофных дрожжей . СЬоФДГ и пекарских дрожжей vii 8сеФДГ и растений . АгаФДГ и сои i x уФДГ. Гены РБеФДГ, СЬоФДГ и БсеФДГ были клонированы в нашей лаборатории, ген МогФДГ был клонирован нами совместно с проф. К. Асано из Университета префектуры Тояма и проф. Н. Есаки из Университета Киото Япония. Плазмиды с полноразмерными генами АгаФДГ и С1уФДГ включая сигнальные последовательности для транспорта в митохондрии были любезно предоставлены проф. Марквелом из Университета штата Небраска Линкольн, США и проф. Н.Лабру из Сельскохозяйственного Университета Афин Греция соответственно. Целью данной работы являлось получение рекомбинантных растительных формиатдегидрогеназ и комплексное изучение структуры и термостабильности ФДГ из бактерий РБеФДГ, МогФДГ, дрожжей СЬоФДГ, ЗсеФДГ и растений АгаФДГ, С1уФДГ. II. Формиатдегидрогеназы присутствуют во многих микроорганизмах, растущих на метаноле. Реакция окисления формиата до СОг является одним из основных источников энергии в клетках этих штаммов. ЫАОзависимые ФДГ найдены во всех метанолутилизирующих дрожжах родов i, ii, и выделены и охарактеризованы из многочисленных штаммов бактерий . В то же время у бактерий такие ферменты распространены не столь широко. В настоящее время в бактериях обнаружено несколько типов ферментов, окисляющих формиат. Некоторые из них входят в состав пируватдегидрогеназного комплекса и, как, например, в клетках . В активном центре формиатдегидрогеназ других типов имеются ионы вольфрама, молибдена, железосерные кластеры и т. Фактически до середины х годов прошлого века были известны всего 3 бактериальных штамма . ФДГ были выделены в гомогенном виде. Первым микроорганизмом, из которого был клонирован ген ФДГ, были дрожжи 5. Через 4 года в г. ФДГ, на этот раз из бактерий . Проведенное в середине х годов сравнение свойств ФДГ из дрожжей и бактерий показало, что последние превосходят дрожжевые ферменты как по активности, так и по стабильности. Особенно стабильной оказалась ФДГ из . ФДГ. В результате основной акцент при поиске новых ФДГ для пракгического применения в последующие годы был сделан на бактериальные ферменты. Начиная с г. ФДГ из x . II. За этот же период гены дрожжевых ФДГ были клонированы из i i , . ФДГ из С. Вторым, не менее важным источником информации о структуре генов и аминокислотных последовательностях ФДГ является анализ данных по секвенированию целых геномов различных организмов. В случае бактерий гены с очень высокой гомологией к ФДГ из . I , индустриального штамма viii , некультивируемых морских альфа и гаммапротеобактерий НОТ2С и ЕВАСЗ1А , а также на мегаплазмиде симбиотических азотофиксирующих бактерий iii ii . Анализ результатов частичного секвенирования геномов гемиаскомицетных дрожжей v. ФДГ имеется только в штаммах ii , ii v. Полное секвенирование генома . IV. VVV1. VVI VV2 VIVI IVI VI С IV XI VI. I IVIVI IVIVI 1VIIXV2 I. VI VIVX. IiIIX, V V. I 7iI II7 ii I

I . I1 iiXI, I . IVVV IVI V i

. IIVViIVIV V. VVVXIVIVI. IVI1VVI7VV. I.II. V VI XIII I. VXVVVV IIX IVIXI VVIVVII IVIIIVViVVII IIVVIVViVVVIVIVI 1 V I IVVIVVVVVVV II7II II VVVVVV I 1 К V 7 КI I VIVVVVV IVI iXIVViI VVIVVVVI. IVV IXV0IIVV2VIViVV

. IV VIVVXV VIVIVV. VVVIXVi V. IIiXV IVIVXII V. VVV . V

v

i




. V1VI XI II7IV7IVV IiXIIXiIIIV VIVI7XI,. IVVIXXiiIVV I V I 1. I I XXV I3I VVX IV7II7. К 9 X С X I 1
I I I III I I I7I i 7 VI

v

i



9 i . I I IiV IIVX III. Рис. Аминокислотные последовательности ФДГ из бактерий . РБеФДГ, ii . ТЬаФДГ, некультивируемых гаммапротеобактерий ЕВАСА псФДГ, i vi . МауФДГ, , концевая часть фермента из мыши МшиФДГ, I ФДГ из высших растений картофеля Ро1ФДГ, ii i АгаФДГ, , ячменя ВагФДГ, 2 и риса iv КшФДГ, АВ дрожжей . БсеФДГ, 6, i iiii СЬоФДГ, и ii НапФДГ, бывшая , 7, микроскопических грибов i 1 СгеФДГ, X, i ФДГ, и ИеиФДГ .