Регуляция активности глутатионредуктазы из печени крысы при токсическом гепатите и действии гепатопротекторов

• Автор: Агарков, Александр Алексеевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 222 с.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Токсическое поражение печени

Общая характеристика гепатитов

Механизм токсического поражения печени четыреххлористым

углеродом

Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная система

Образование свободных радикалов

Образование активных форм кислорода и пероксидное окисление липидов

Роль евободнорадикального окисления в норме и при патологии

Антиоксидантная система защиты
Антиоксидантные свойства тиоктовой кислоты
Восстановленный глутатион, как компонент антиоксидантной системы
Характеристика глутатионредуктазы из различных источников Катализируемая реакция
Исследование генов, кодирующих глутатионредуктазу, и ее субклеточное распределение
Исследование структуры глутатионредуктазы
Распространение и очистка глутатионредуктазы
Молекулярная масса глутатионредуктазы
Зависимость активности глутатионредуктазы от концентрации субстрата и кофермента
Влияние и температуры на скорость реакции, катал и зи ру е мой гл у татио н р еду ктазо й
Регуляция активности глутатионредуктазы
1.5.9. Активность глутатионредуктазы при действии неблагоприятных факторов и патологии
1.5 Перспективы практического применения глутатионредуктазы
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объект исследования
2.2. Методы исследования
2.2.1. Создание модели экспериментального токсического гепатита
2.2.2. Определение активности ферментов
2.2.3. Получение субклеточных фракций гепатоцитов
2.2.4. Определение количества белка
2.2.5. Выделение и очистка глутатионредуктазы из печени крыс
2.2.5.1. Экстракция фермегга
2.2.5.2. Фракционирование белков с помощью сульфата аммония
2.2.5.3. Гельфильтрация на сефадексе 0
2.2.5.4. Ионообменная хроматография на ДЭАЭцеллюлозе
2.2.5.5. Концентрирование фракций фермента
2.2.5.6. Гельхроматография на ТоуореаН НУ
2.2.6. Исследование кинетических характеристик и регуляции
активности фермен та
2.2.7. Аналитический электрофорез
2.2.8. Определение молекулярной массы фермента
2.2.9. Экстракция тотальной РНК тризоловым методом
2.2 Электрофорез РНК
2.2 Обратная транскрипция
2.2 НЦРамплификация в режиме реального времени
2.2 Определение уровня экспрессии генов
2.2 Электрофорез ДНК
2.2 Статистическая обработка результатов
ГЛАВА 3. АКТИВНОСТЬ, СУБКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ И ОЧИСТКА
ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ ИЗ ПЕЧЕНИ КРЫСЫ В НОРМЕ, ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ И ДЕЙСТВИИ ГЕПАТОПРОТЕКТОРОВ
3.1. Исследование активности глутатионредуктазы из печени крыс
в норме, при токсическом гепатите и введении протекторов при патологии
3.2. Исследование субклеточной локализации глутатионредуктазы
3.3. Очистка глутатионредуктазы из печени крыс исследуемых
ГЛАВА 4. ФИЗИКОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И КИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ КАТАЛИТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ ИЗ ПЕЧЕНИ КРЫСЫ В НОРМЕ, ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ И ДЕЙСТВИИ ВЕЩЕСТВПРОТЕКТОРОВ
4.1. Молекулярная масса глутатионредуктазы
4.2. Исследование кинетических параметров каталитического
действия глутатионредуктазы в норме, при экспериментальном токсическом гепатите и действии
Iепатопротскторов
4.3. Влияние концентрации ионов водорода на активность
глутатионредуктазы из печени крыс в норме, при экспериментальном токсическом гепатите и при введении гепатопротекторов
4.4. Исследование влияния температуры па активность
глутатионредуктазы из печени крыс в норме, при патологии
и при введении гепатопротекторов
ГЛАВА 5. РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ
ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ ИЗ ПЕЧЕНИ КРЫСЫ В НОРМЕ, ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ И ДЕЙСТВИИ ГЕПАТОПРОТЕКТОРОВ
5.1. Влияние интермедиатов пситозофосфатного пути на
активность глутатионредуктазы
5.2. Влияние интермедиатов цикла Кребса на активность
глутатионредуктазы
5.3. Влияние нуклеотидфосфатов на активность
глутатио 1реду ктазы
5.4. Участие ионов металлов в регуляции активности
глутатионредуктазы в норме, при токсическом поражении печени и введении гепатопротекторов на фоне развития
патологии
5.4.1. Влияние ионов магния па активность глутатионредуктазы
5.4.2. Влияние ионов Са , Си на активность глутатионредуктазы
5.4.3. Влияние ионов железа на активность глутатионредуктазы
5.5. Влияние тиоктовой кислоты и восстановленного глутатиона
на активность глутатионредуктазы в норме, при токсическом
гепатите и при введении гепатопротекторов
ГЛАВА 6. ЭКСПРЕССИЯ ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ В
ПЕЧЕНИ КРЫСЫ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ТОКСИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ И ДЕЙСТВИИ ГЕПАТОПРОТЕКТОРОВ ПРИ ПАТОЛОГИИ
6.1. Выделение тотальной РНК из печени крысы
6.2. Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция
6.3. Оценка уровня экспрессии с гена глутатионредуктазы в норме,
при токсическом гепатите и при введении гепатопротекторов
при патологии
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


О возникает также при взаимодействии супсроксиднот радикала с гидроксильным радикалом ОН ОРГ г . Гидроксильный радикал является наиболее реакционноспособным из всех АФК, образующихся в биологических системах. Он может вызывать повреждения многих типов биополимеров. Гидроксильный радикал обладает сильным цитотоксическим, мутагенным и канцерогенным действием. Он может разрывать любую СН и ССсвязь 1. Гидроксильный радикал вызывает повреждение ДНК, фибронектина, альбумина, других молекул и клеточных структур . Считается, что цитотоксическое действие кислородных радикалов более чем на обусловлено ОН радикалами, при этом в клетках критическими объектами являются нуклеиновые кислоты и мембранные белки , . Сильная окислительная способность ОН радикалов приводит кмножественным нарушениям мембран и к гибели клеток вследствие модифицикации белков, нуклеиновых кислот, индукции ПОЛ . ПОЛ представляет собой экзотермический процесс непосредственного акцептирования АФК на молекулах полиненасыщениых жирных кислот ПНЖК. Процесс ПОЛ тесно связан с метаболизмом компонентов клетки, в том числе с обновлением состава фосфолипидов. Это макроскопический процесс, протекающий во всех типах мембран и играющий значительную роль в регуляции клеточного метаболизма в норме и при действии различных повреждающих факторов 3. Необходимо отметить, что увеличение концентрации СР в системе приводит к активации пероксидного окисления. ПНЖК в биологических системах имеет место диеновая конъюгация, указывающая на наличие свободнорадикальной стадии процесса, вместе с тем, введение в систему антиоксидантов АО подавляет образование пероксидов липидов в биологических мембранах . Процесс ПОЛ специфический катаболический путь, протекающий по цепному механизму с вырожденным разветвлением и осуществляется в несколько стадий инициирование, продолжение, разветвление и обрыв цепи , , , , , . II2 Н0О2 i8,1 реакция инициации цепи 2. ПОЛ сопровождается окислением сульфидгидрильных групп мембранных белков, что ведет к появлению дефектов в мембранах клеток и митохондрий. Через такие поры под действием разности электрических потенциалов в клетки входят ионы натрия, а в митохондрии ионы калия. В результате увеличивается осмотическое давление внутри клеток и митохондрий и происходит их набухание. Это приводит к еще большему повреждению мембран. Продукты ПОЛ обладают способностью увеличивать ионную проницаемость липидного слоя. Так, показано, что продукты ПОЛ делают липидную фазу мембран проницаемой для ионов водорода и кальция. АТР и клетка оказывается в условиях энергетического голода. ПОЛ уменьшает стабильность липидного слоя, что может привести к электрическому пробою мембраны иод действием разности потенциалов, которую сама мембрана и создает , . Выделяют три типа продуктов ПОЛ первичные, промежуточные вторичные и конечные. К первичным продуктам ПОЛ относятся гидроперекиси Г1НЖК. С них начинается цепная реакция СРО липидов. Они обладают высокой реакционной способностью. На мембранах и в цитоплазме клеток они легко взаимодействуют с метильными, сульфгидрильными, аминогруппами белков и, таким образом, инактивируют ферменты 3. Гидроперекиси нарушают энергетическое обеспечение адаптационного процесса, разобщая процессы окисления и фосфорилирования в митохондриях . Вторичные продукты пероксидации липидов образуются в реакциях распада перекисей липидов, катализируемых ионами металлов переменной валентности 2. Эти соединения входят в обширную группу альдегидов, кетоиов, спиртов и эпоксидов. Диальдегиды МДА, очень активно взаимодействуя с аминогруппами белков, фосфолипидов, образуют конечные продукты пероксидации липидов, которые являются относительно инертными. Тем не менее, они, накапливаясь в клетках, инактивируют ферменты и другие биологически активные вещества, а также служат балластом и помехой жизнедеятельности , 1. Известно, что в живом организме поддерживается определнная интенсивность процессов ПОЛ. Сбалансированное взаимодействие всех систем, вовлекаемых в процесс ПОЛ, необходимое условие для нормальной регуляции СРО липидов в мембранах клетки.