Пролиферативный антиген инициалей в исследовании морфогенетических процессов в культуре in vitro пшеницы

• Автор: Фадеева, Ирина Юрьевна
• Шифр специальности: 03.00.04, 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 120 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ И

1.1 Клеточные антигены как фенотипические маркеры морфогенетических процессов и функционального состояния растительных клеток

1.2 Регуляция клеточного цикла в живых организмах

1.3 Роль белков в восприятии и передаче сигналов в геном растительной клетки

1.4 Молекулярные маркеры растений, связанные с морфогенезом в

культуре i vi

1.5 Пролиферативный антиген инициален как молекулярный маркер меристематических клеток пшеницы

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Выделение суммарной водорастворимой фракции меристематических белков растений различных таксономических i
2.2 Получение моноспецифических антител к ПАИ
2.3 Очистка антител
2.3.1 Фракционирование сыворотки каприловой кислотой
2.3.2 Ионообменная хроматография
2.4 Электрофорез в полиакриламидном геле
2.5 Двойная иммуподиффузия в агарозном геле
2.6 Иммунодотблотанализ
2.7 Твердофазный иммуноферментпый анализ
2.8 Условия культивирования незрелых зародышей пшеницы в
культуре i vi и морфометрический анализ
2.9 Выделение субклеточных фракций пшеницы с использованием
дифференциального центрифугирования
2.9.1 Выделение хлоропластов
2.9.2 Выделение митохондрий
2.9.3 Выделение мембранной и цитозольной фракций
2.9.4 Выделение ядер
3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Усовершенствование методики получения моноспецифических антител к ПАИ
3.2 Очистка антител к ПАИ с использованием каприловой кислоты в комбинации с ионообменной хроматографией
3.3 Исследование субклеточной локализации ПАИ
3.4 Исследование иммунохимической гомологии цитоплазматических белков меристем растений различных таксономических групп
3.5 Исследование динамики содержания ПАИ в соматических каллусах изогенных линий пшеницы, альтернативных по генам, в процессе каллусогснсза и вторичной дифференциации
3.6 Сравнительный анализ содержания ПАИ в культуре i vi и i viv пшеницы
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВА IIЮЙ ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
АБК абсцизовая кислота АГ антиген
АГБ арабиногалактановые белки
АТ антитело
АТФ аденозшггрифосфат
БСА бычий сывороточный альбумин
Дадальтон, единица измерения молекулярной массы
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
ДСН додецил сульфат
ДТТ дитиотрейтол
ИБФРМ РАН Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН
ММ молекулярная масса
НАФ неполный адъювант Фрейнда
ПААГ полиакриламидный гель
ПАИ пролиферативный антиген ииициалей
ПАФ полный адъювант Фрейнда
ПЭГ полиэтиленгликоль
РНК рибонуклеиновая кислота
СИБ сигналиндуцированные белки
СТС сигналтрансдукторные системы
ФРТ факторы регуляции транскрипции
ЭДТА соль динатриевая этилендиаминтетрауксусной кислоты
ЭФ электрофорез
АВР ауксинсвязывающий белок xiii i
АНК гистидинкиназа ii ii iii i
ауксинрегулируемый транскрипционный факгор xi
регулятор факторов транскрипции ii
САК активирующая киназа ivi i
гены, контролирующие клеточное деление ivii
циклинзависимая киназа i i
вспомогательный белок i
Сус циклин i
белки ГТФактивируемые белки I ингибитор iii
I иммуноглобулины
белок, ингибирующий активность i i МАРкиназы митогенактивируемыс протеиикиназы iiv i i
цитоплазматический фактор, вызывающий переход клеток к митозу i i
2 протеинкиназа с молекулярной массой кДа, регулирующая клеточный цикл
вспомогательный белок ДНКполимсразы ii i
фенилметилсульфоиил фгорид iii
гены i гены короткостебельности
сульфопропил
ТЕМ тетраметилэтилендиамии
I1 белок бокса, рецептор ауксина iii
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Исследовать динамику содержания ПАИ в соматических каллусах почти изогенных линий пшеницы, альтернативных по генам короткостебельности , в процессе каллусогенеза и вторичной дифференциации. Провести сравнительный анализ содержания ПЛИ в меристематических зонах i viv и каллусных клетках i vi почти изогенных линий пшеницы, альтернативных по ряду генов короткостебел ьности . Научная новизна работы. Впервые проведено исследование внутриклеточной локализации ПЛИ. Показано, что ПАИ является цитозольным белком. Впервые обнаружена иммуиохимическая гомология ПАИ цитоплазматическим белкам растений различных таксономических групп. Выявлена общая закономерность динамики содержания ПАИ в процессе каллусогенеза и вторичной дифференциации в культуре i vi на генетической модели, включающей 7 генотипов яровой мягкой пшеницы. На примере трх генов короткостебел ьности , 4 и I показано их влияние на содержание ПАИ в каллусных клетках пшеницы. Впервые установлено, что содержание ПАИ в меристематических клетках узлов кущения почти изогенных линий пшеницы i viv в целом отражает морфогенетический потенциал соматических каллусов тех же линий в культуре i vi. Впервые показано, что уровень содержания ПАИ в каллусных клетках пшеницы позволяет оценить их морфогенетическую способность на более ранних этапах по сравнению с морфометрическим анализом. Научнопрактическая значимость. Полученные результаты позволяют рекомендовать ПЛИ для исследований морфогенетических процессов в растениях, что открывает перспективу его использования в соответствующих отраслях агробиотсхнологии в качестве дополнительного критерия морфогенетической способности тестируемых линий пшеницы в селекционной работе. Кроме того, предложенная нами стратегия получения высокоспецифических поликлональных антител может быть использована в иммуиохимических исследованиях белков эукариотических и прокариотических клеток. Результаты работы используются в учебном процессе при подготовке курсовых и дипломных работ студентов в Саратовском государственном университете им. Н.Г. Чернышевского и в Саратовском государственном аграрном университете им. Н.И. Вавилова. Апробация работы. Вавиловские чтения Саратов, Россия, , на Всероссийских конференциях Вавиловские чтения , , Саратов, Россия, . Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории физической химии клеточных струкгур ИБФРМ РАН. Публикации. По теме диссертации опубликовано работ, в том числе 2 статьи в отечественных рецензируемых научных изданиях. Основные положения диссертации, выносимые на защиту. ПАИ выявляется только в цитозоле меристематических клеток пшеницы и не обнаружен в ядрах, хлоропластах, митохондриях, плазмалемме и мембранных фракциях ряда клеточных органелл. Цитоплазматические белки ржи, сорго, подсолнечника и вольфии содержат антигенные детерминанты, гомологичные детерминантам ПАИ. Гены короткостебелыюсти КЫВ1с, КЫ и ЯЫВ1Ь оказывают влияние на динамику содержания ПАИ в процессе каллусогенеза и вторичной дифференциации соматических каллусов почти изогенных линий пшеницы, альтернативных но этим генам. Содержание ПЛИ в меристематических клетках узлов кущения почти изогенных линий пшеницы в нолевых экспериментах i viv в целом отражает морфогенетическую способность каллусной ткани тех же линий в культуре i vi. Определение содержания ПАИ в соматических каллусах пшеницы позволяет оценить их морфогенетическую способность на более ранних этапах по сравнению с морфометрическим анализом, что открывает перспективу его использования в агробиотехнологии в качестве дополнительного критерия в селекционной работе. Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 2 источника, в том числе 9 зарубежных. Работа изложена на 9 сграницах машинописного текста, содержит рисунков. Работа выполнена в лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН в соответствии с плановой темой НИР Разработка эффективных тестсистем к антигенным структурам клеток микроорганизмов и растений гос. Научный руководитель зав. С.Ю. Щеголев.