Роль структурно-функциональных изменений малатдегидрогеназы в адаптации микроорганизмов к факторам внешней среды

• Автор: Парфёнова, Наталья Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 151 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Физиологобиохимические особенности жизнедеятельности микроорганизмов родов i, ЬеисоШгх, УисапНегтия

1.1.1. Разнообразие типов метаболизма бактерий

1.1.2. Органотрофный и литотрофный рост бактерий рода i

1.1.3. Окологобиохимическая характеристика рода ЬеисоШпх

1.1.4. Особенности метаболизма термофильных бактерий УисапЬегтиз

тесНоаапбсиз

1.2. Трансформация метаболизма бактерий в различных условиях внешней среды

1.2.1. Влияние химического состава среды

1.2.1.1. Роль серных соединений
1.2.2. Действие физических факторов
1.2.2.1. Влияние кислорода
1.2.2.2. Значение давления
1.2.2.3. Влияние температуры
1.2.3. Адаптивные изменения ферментных систем
1.3. Физикохимические и регуляторные свойства малатдегидрогеназы
1.3.1. Способы получения высокоочищенных препаратов МДГ
1.3.2. Общая характеристика каталитического действия
1.3.3. Кинетические параметры
1.3.4. Влияние концентрации ионов водорода
1.3.5. Влияние интермедиатов и ионов
1.3.6. Аллостерическая регуляция
1.4. Различные уровни организации МДГ
1.5. Влияние температуры на активность фермента
1.5.1. Температурный оптимум
1.5.2. Термостабильность малатдегидрогеназы
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Цель и задачи исследования
2.2. Объекты и методы исследования
2.2.1. Объекты исследования
2.2.2. Методы исследования
2.2.2.1. Состав питательных сред для культивирования микроорганизмов
2.2.2.2. Определение активности фермента
2.2.2.3. Определение количества белка
2.2.2.4. Выделение и очистка малатдегидрогеназы
2.2.2.5. Электрофоретические исследования
2.2.2.5.1. Аналитический электрофорез
2.2.2.5.2. Определение гомогенности ферментных препаратов
2.2.2.5.3. Специфическое проявление малатдегидрогеназы
2.2.2.5.4. Определение молекулярной массы субъединиц МДГ
2.2.2.6. Определение молекулярной массы нативного фермента
.2.1. Ингибиторный анализ
2.2.2.8. Исследование кинетических характеристик и регуляции активности активности ферментов
2.2.3. Статистическая обработка экспериментальных данных
2.3. Полученные результаты и их обсуждение
2.3.1. Получение гомогенных препаратов МДГ из бактерий родов i, Ьеисопх, УисапЬегшиз
2.3.1.1. Очистка малатдегидрогеназы
2.3.1.2. Определение гомогенности ферментных препаратов
2.3.2. Четвертичная структура малатдегидрогеназы из изучаемых бактерий
2.3.2.1. Определение молекулярной массы нативного фермента
2.3.2.2. Молекулярная масса субъединиц МДГ
2.3.3. Кинетические и регуляторные характеристики МДГ
2.3.3.1. Влияние концентрации ионов водорода
2.3.3.2. Определение константы Михаэлиса
2.3.3.3. Кооперативные свойства тетрамерной формы малатдегидрогеназы из i 1еритШтш Д
2.3.3.4. Определение константы субстратного ингибирования
2.3.3.5. Влияние интермедиатов и ионов на активность МДГ
2.3.4. Изменение субъединичной структуры малатдегидрогеназы у бактерий в различных условиях культивирования
2.3.4.1. Четвертичная структура МДГ из i 1ер1отШйптпз в условиях разного типа питания
2.3.4.2. Влияние типа питания на четвертичную структуру МДГ из бактерий ЬешхнЬпх тисог
2.3.4.3. Влияние ротенона и итаконата на соотношение димерной и тетрамерной форм МДГ
2.3.4.4. Механизм структурных изменений малатдегидрогеназы при воздействии тиосульфата
2.3.4.5. Хранение димерных V и тетрамерных форм МДГ в присутствии стабилизирующих веществ
2.3.4.5. Влияние температуры
2.3.4.5.1. Температурный оптимум
2.3.4.5.2.Термостабильность
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ


Органотрофный и литотрофный рост бактерий рода i. Бактерии рода i являются представителями группы бесцветных нитчатых скользящих грамотрицательных серобактерий. Это градиентные микроорганизмы, которые занимают в природе специфические экологические ниши, характеризующиеся совместным присутствием кислорода и сероводорода, и образуют одни из самых заметных микробных скоплений, так называемые серные маты . Большинство экологических ниш бесцветных серобактерий характеризуется также одновременным наличием органического вещества. Существуя в пограничных областях между аэробной и анаэробной зонами, эти бактерии играют важную роль в окислении токсичных серных соединений органической и неорганической природы и предотвращении их поступления в вышележащие слои воды. Бактерии рода i широко распространены в водомах различного типа пресных, морских, в районах океанических гидротерм и в антропогенных экосистемах, их рост наблюдается в серных источниках, они могут покрывать разлагающиеся остатки растений и животных, находиться в бытовых и промышленных сточных водах. Для бесцветных серобактерий характерно большое разнообразие метаболических путей, варьирующих на видовом и штаммовом уровнях Грабович и др. Патрицкая и др. Среди них встречаются облигатные и факультативные автотрофы, органогетеротрофы, литогетеротрофы, а также миксотрофы, для которых источниками энергии или углерода служат как органические, так и неорганические соединения , , . К факторам, контролирующими переход от одного типа питания к другому, относятся, прежде всего, наличие неорганического донора электронов соединений серы, кислородный режим, а также природа источника углерода Грабович и др. Так, например, i и i штамм Д5 способны лишь к хемоорганогетеротрофному росту, используя в качестве донора электронов и источника углерода органические соединения лактат, пируват, сукцинат, малат и другие. Д2 обладают более мобильным типом метаболизма. В зависимости от условий среды они способны переходить от одного типа питания к другому и расти как хемоорганогстеротрофно, так и хемолитогетсротрофно, используя в качестве источника энергии органические доноры электронов или восстановленные соединения серы например, тиосульфат натрия, сероводород. Переход от органотрофного к литотрофному росту сопровождается существенной перестройкой углеродного метаболизма. Патрицкая, . В. iii Д2 в несколько раз снижается активность дегидрогеназ цикла трикарбоновых кислот вследствие загруженности электронтранспортной цепи потоком электронов от окисляемых серных соединений. Одновременно активизируются ферменты глиоксилатного цикла, ответственного за биосинтетические ростовые процессы. Таким образом, серобактерии, относящиеся к роду i, характеризуются различным типом обмена. Экологобиохимическая характеристика рода ix. Представители рода ix, как и i, относятся к группе бесцветных скользящих нитчатых серобактерий. Дульцева и др. Старынин и др. До недавнего времени род ix был представлен единственным видом ix , , который относили к несерным бактериям. Однако при изучении особенностей метаболизма у новых штаммов рода ix, включая типовой вид . Грабович и др. При хемолитогетеротрофном росте в присутствии серных соединений эти бактерии внутриклеточно накапливают элементную серу, что позволило отнести данные организмы к группе бесцветных нитчатых серобактерий. Бактерии рода ix могут осуществлять регуляцию окислительного метаболизма в зависимости от присутствия неорганических доноров электронов в среде. В частности, при росте бактерий на тиосульфате снижается роль ЦТК в энергетическом метаболизме клеток и индуцируется работа глиоксилатного цикла, поставляющего интермедиаты для конструктивного метаболизма. Штамм . Такая особенность метаболизма объясняется тем, что у . ЦТК по сравнению с другими представителями рода довольно высока, и поэтому включение соединений серы в энергетический метаболизм бактерий осуществляется лишь при недостаточном снабжении клеток потребляемым органическим субстратом для обеспечения конструктивного и энергетического обменов.