Фосфорилирование киназы легких цепей миозина и белка KRP в регуляции сократительной активности гладких мышц

• Автор: Хапчаев, Аскер Юсуфович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 125 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ имиммммимамммм1мммммимммимитммммммимм

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ультраструктура сократительного аппарата гладких мышц

и немышечных клеток

1.1. Миозин как основная мишень КЛЦМ и .

2. Генетический локус КЛЦМ.

3. Киназа легких цепей миозина.

3.1. Субстратная специфичность КЛЦМ и кинетика

фосфорилирования РЛЦ.

3.2. Каталитический домен.
3.3. Регуляторный сегмент.
3.4. Участки связывания актина и миозина
3.5. Повторяющиеся структурные элементы.
3.6. Модель функционирования КЛЦМ в клетке
4. АКЛЦМ
5. .
6. Фосфорилирование продуктов генетического локуса КЛЦМ
6.1. Фосфорилирование КЛЦМ
6.2. Фосфорилирование .
7. Общие принципы регуляции сокращения гладких мышц
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Материалы.
2. Методы
2.1. Биохимические методы.
2.1.1.Определение концентрации белков.
2.1.2.Приготовление образцов тканей для электрофореза.
2.1.3.Элекгрофорез белков в ПААГ и денситометрия
2.1.4.Иммуноблотгин г.
2.1.5.Коседиментационный анализ.
2.1.6.0пределение активности КЛЦМ.
2.1.7.Фосфорилирование белков i vi
2.1.8.Фосфоаминокислотный анализ
2.1.9.Двумерное фосфопептидное картирование.
2.1 Аффинная очистка антител 5 и 8
2.1 Очистка рекомбинантных белков.
2.11. .
2.12. содержащие белки
2.13. МВРсодержащие белки
2.14. Мвбсодержащие белки
2.1 Выделение актина из скелетных мышц
2.1 Получение нативных миофиламентов
2.2. Молекулярнобиологические методы.
2.2.1.Полимеразная цепная реакция ПЦР.
2.2.2.Генетическое конструирование фрагмента для
бактериальной экспрессии
2.2.3.Введение точечных аминокислотных замен
2.2.3.1.Получение мутанта .
2.2.3.2.Получение мутанта ТА.
2.2.4.Трансформация клеток . i
2.2.5.Выделение плазмидной ДНК из клеток . i
2.2.6.Бактериальная экспрессия рекомбинантных белков
2.3. Физиологические измерения
РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ
1. Участки фосфорилирования домена КЛЦМ
1.1. Определение участка, фосфорилируемого и р киназами в домене КЛЦМ
1.2. Фосфо и сайтоспецифичные антитела против КЛЦМ.
2. Фосфорилирование КЛЦМ и в фазных гладких мышцах.
2.1. Форболовый эфир вызывает активацию киназ в фазных
гладких мышцах
2.2. Динамика фосфорилирования и при сокращении
и расслаблении фазных гладких мышц
2.3. Уровень эндогенного фосфорилирования и i viv.
2.4. Фосфорилирование активируемой киназой i vi.
2.5. Фосфорилирование не влияет на его взаимодействие с
миозином и нативными миофиламентами.
2.6. Фосфорилирование домена не влияет на взаимодействие
КЛЦМ с миозином
2.7. Дифференциальная экстракция фосфорилированных и
КЛЦМ из гладкомышечной ткани
3. Фосфорилирование КЛЦМ в тонических гладких мышцах.
3.1. зависимое сокращение тонической гладкой мышцы зависит
от активации МАРкиназ
3.2. Влияние фосфорилирования I киназой i vi на
ферментативную активность КЛЦМ
3.3. Фосфорилирование КЛЦМ при стимулируемом сокращении тонических мышц.
3.4. Определение остатка, фосфорилируемого МАРкиназами,
в концевой области КЛЦМ.
3.5. Эффект фосфорилирования КЛЦМ МАРкиназами.
3.5.1 .Влияние фосфорилирования на связывание с актином
3.5.2.Взаимодействие с кальмодулином и эффект
фосфорилирования .
3.6. Фосфорилирование КЛЦМ киназой ослабляет ее взаимодействие
с актином и нативными миофиламентами
ОБСУЖДЕНИЕ . ..i.iiii.iiiiii8
Фосфорилирование как способ модуляции сокращения гладких мышц
Роль МАРкиназ.
Фосфорилирование и десенситизация фазной мускулатуры.
Фосфорилирование КЛЦМ и сенситизация тонических мышц.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
ЛИТЕРАТУРА


В цитоплазме плотные бляшки контактируют также с системой промежуточных филаментов, построенных из десмина и виментина и служащих для связывания миофиламентов в единую сеть. В силу таких ультраструктурных особенностей распределение миофиламентов в дифференцированной гладкомышечной клетке практически не изменяется. В немышечных клетках актомиозин сходным образом организован в волокна, в виде пучков пронизывающих цитоплазму или расположенных субкортикально под мембраной. Основное отличие актомиозиновой системы немышечных клеток от глаткомышечного сократительного аппарата ее динамический характер. Двигательные процессы в немышечных клетках протекают локально с частой переменой вектора натяжения или сокращения и сопровождаются постоянной перестройкой актомиозина. Структура актиновых филаментов достаточно консервативна для всех типов мышц и немышечных клеток. Поэтому отсутствие разделения несаркомерных миофиламентов на сократительные единицы определенной длины во многом связано со специфическими особенностями миозина гладких мышц и его способностью полимеризоваться в филаменты, отличные от филаментов миозина поперечнополосатых мышц. Миозин II типа основной молекулярный мотор всех эукариотических клеток. Хотя миозины II типа поперечнополосатых мышц, гладких мышц и немышечных клеток являются продуктами разных генов, все эти белки имеют, в целом, сходную молекулярную организацию, различаясь способом филаментообразования и регуляции их моторной активности. Молекула миозина II типа состоит из двух тяжелых около 0 кДа и двух пар легких цепей существенных и регуляторных с массой и кДа, соответственно пит. Эти субъединицы формируют единую молекулу, состоящую из стержневого хвоста, связанного через так называемую шейку с двумя глобулярными головками. Филаменты образуются путем латеральной агрегации хвостовых частей молекул миозина. В филаментах гладкомышечного и немышечного миозинов головки располагаются вдоль боковой поверхности филамента и на разных его сторонах имеют противоположную ориентацию, образуя филаменты с боковой полярностью X . Головка молекулы миозина так называемый субфрагмент 1 образована концсвой частью тяжелой цепи миозина и ассоциированными с ней двумя парами легких цепей так называемых существенных и регуляторных. В состав 1 входят центры связывания 2АТР и актина и связывание этих лигандов приводит к изменению конформации головки миозина. Установлено, что 1 является необходимой и достаточной частью молекулы миозина, способной осуществлять движение в присутствии актина и 2, так как в этой части молекулы сосредоточен ее моторный домен i . Обнаружен ряд тканеспецифичных изоформ миозина гладких мышц i i, , которые различаются АТРазной активностью и скоростью транслокации акгиновых филаментов i vi . i . Регуляторные легкие цепи РЛЦ расположены в области шейки миозина и обвивают тяжелую цепь миозина так, что их и Сконцевые участки оказываются вблизи друг от друга . Xi . Повидимому, одной из важнейших функций РЛЦ является стабилизация длинной аспирали внутри 1, обеспечивающей передачу сигнала от шейки к апикальной части головки, 2 и актинсвязывающим центрам. В дефосфорилированном миозине взаимодействие головок друг с другом препятствует конформационным изменениям и гидролизу в активном центре . Активация миозина происходит под действием КЛЦМ, специфически фосфорилирующей остаток РЛЦ I . РЛЦ, вышеупомянутой аспирали и, повидимому, взаимодействие головок миозина, приводя к экспонированию актинсвязывающих участков 1, активации 23i миозина актином и развитию сокращения. В гладкомышечных и немышечных клетках фосфорилирование РЛЦ миозина под действием КЛЦМ играет ведущую роль в регуляции актомиозинзависимых процессов. Оно многократно стимулирует актинакгивируемую 23 миозина и запускает сокращение гладких мышц i, i, и немышечных клеток . i . i . i .