Молекулярно-генетическая характеристика OMPF поринов бактерий рода YERSINIA и разработка ПЦР тест-системы для идентификации патогенных видов

• Автор: Стенкова, Анна Михайловна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 101 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

I. ВВЕДЕНИЕ.

2.0БР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИЕРСИНИЙ

2.1.1. Классификация и таксономия.

2.1.2. Генетическое родство

2.1.3. Экологоэпидсмоологические особенности иерсиний.

2.2. КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ И ДИАГНОСТИКА ИЕРСИНИОЗОВ

2.2.1. Клиническая значимость иерсиний.

2.2.2. Методы идентификации иерсиний.

2.3. ГЛАВНЫЕ ПОРИНЫ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ
2.3.1. Строение главных портов.
2.3.2. Первичная и вторичная структуры ОтрГподобных портов
2.4. ФИЛОГЕНИЯ И ЭВОЛЮЦИЯ БЕЛКОВ
НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ БАКТЕРИЙ.
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
4.1. ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ И
ЭВОЛЮЦИЯ ОМРК ГЕНОВ ИЕРСИНИЙ.
4.1.1. Секвенировапис и филогенетический
анализ 8рДНК и угВ генов иерсиний.
4.1.2. Секвенирование и филогенетический анализ отрГ генов иерсиний
4.1.3. Молекулярная эволюция отрГ гена иерсиний
4.2. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ И СТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ
ВАРИАНТОВ ОМРР ПОРИНОВ ИЕРСИНИЙ
4.2.1. Анализ первичной структуры ОтрГ поринов иерсиний
4.2.2. Анализ петельных участков ОтрГ поринов иерсиний
4.2.3. Построение теоретических моделей структурных
вариантов ОтрИ поринов иерсиний
4.3. РАЗРАБОТКА И АРОБАЦИЯ МНОГОПРАЙМЕРНОЙ ПЦР ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ БАКТЕРИЙ РОДА II И ИДЕНТИФИКАЦИИ ПАТОГЕННЫХ ВИДОВ.
4.3.1. Разработка мПЦР.
4.3.2. Оптимизация, определение чувствительности и
специфичности тестсистемы.
4.3.3. Апробация мЦР.
5. ВЫВОДЫ
6. СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Д1ПС дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК рибонуклеиновая кислота
рРНК рибосомальиая РНК
эдтл этилендиам и 1ггетраацетат
Н.П. нуклеотидных пар
т.н.п. тысячь нуклеотидных пар
а.о. аминокислотный остаток
а.к. аминокислота
среднеквадратичное отклонение
ПЦР полимеразная цепная реакция
мПЦР миогопраймерная ПЦР
нп нуклеотидные последовательности
лп аминокислотные последовательности
ИФА иммуноферментный анализ
ИМ наружная мембрана
i i
МЕЕ i i
РСА ii i
i i
ВВЕДЕНИЕ


Недавние, нонуляционногенетические исследования показали, что У i эволюционировала от . Однако экология и эпидемиология У. У. i. Клиническое значение других видов остается до сих нор неясным и мало освещенным vi, . В литературе имеются отдельные сообщения о выделении непатогенных иерсииий из клинического материала . Показано, что непатогенные иерсинии могут обладать некоторыми факторами патогенности, например, продуцировать энтсротоксины, вызывающие симптомы пищевого отравления . Смирнов, . Повсеместная распространнность, психротолераитность, варьирующая вирулентность и широкий спектр хозяев создают предпосылки для использования рода ii в качестве модельного рода для генетических и эволюционных исследований патогенеза и экологии бактерий. Хотя работы но ДНКДНК гибридизации и сравнительному анализу генов домашнего хозяйства, показали значительную гетерогенность некоторых видов и послужили основой для характеристики недавно описанных новых видов У iii, У ii, У. В связи с этим, для уточнения таксономии и прояснения филогении и эволюции рода ii необходимо изучение молекулярной эволюции разных генов. На основе этих данных возможна разработка методов быстрой и точной видовой идентификации этих бактерий. Несмотря на последние достижения в области патобиологии патогенных иерсиний, механизмы их адаптации к различным хозяевам и различным условиям окружающей среды ещ недостаточно изучены. Мембранные, поверхностные молекулы, в этом контексте, представляют особый интерес, так как первыми реагируют на изменения условий окружающей среды и участвуют в процессах взаимодействия патогенного микроорганизма и хозяина. Одними из таких молекул являются неспецифические порины доминирующие белки наружной мембраны НМ бактерий, которые обладают уникальными структурными свойствами и функционируют как поры, регулируя проницаемость мембраны , . Типичная пориновая субъединица состоит из антипараллельных тяжей, которые формируют бочонок с короткими псрсплазматичсскимн петлями в нижней его части и длинными наружными петлями в верхней , i, i . Три субъединицы порина образуют стабильный гомотример, который устойчив к действию детергентов и протеаз ключевое свойство необходимое кишечным бактериям для выживания в агрессивной среде пищеварительного тракта. Как превалирующие белки НМ бактерий, некоторые порины участвуют в бактериальном патогенезе, например, адгезии и инвазии . Способность поринов создавать протсктивный иммунитет против бактериальных инфекций была использована для разработки некоторых вакцинных препаратов i . Для шести видов иерсиний . V iii. Воегрикова . Так же для патогенных видов У. Гузев . Но эти исследования были выполнены на маленьком количесгве штаммов и ограниченном числе видов, что не дат полного понимания степени разнообразия поринов. Целью данной работы было изучение полиморфизма и эволюции гена и белка в пределах рода ii и разработка многопраймерной ПЦР тестсистемы для идентификации исрсиний и дифференциации патогенных видов. Генотииирование исследуемых штаммов нерсиний на основе секвснирования генов домашнего хозяйства рДНК и . Определение нуклеотидных последовательностей, филогенетический и эволюционный анализ генов видов иерсиний. Сравнительный анализ и компьютерное моделирование структурных вариантов иоринов иерсиний. Разработка и апробация многопраймерной ПЦР тестсистемы для идентификации бактерий рода ii и дифференциации патогенных видов. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИЕРСИНИЙ 2 1. Род ii, относящийся к семейству i, включает видов бактерий табл. У. iii. X ii, Г. К i, i и К iii . Медицинское значение однозначно установлено для трех видов . В г. Александра Иерсина, впервые выделившего в г. Новый род ii был введен в семейство i. В г. В. Фредериксена к роду ii была отнесена также . В голу в связи с появлением нового метода ДНКДНК гибридизации таксономия исрспний была пересмотрена, в результате трм . Для самого вида . Например, В. В году две биогруппы ЗА и ЗВ были выделены в отдельные виды . В году vi . Х2 и выделенные из водных экосистем. Спустя три года был охарактеризован ещ один вид .