Множественные формы протеинкиназ из клеток асцитной карциномы Эрлиха

• Автор: Токмаков, Александр Александрович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1983
• Место защиты: Ленинград
• Количество страниц: 139 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. сАМРзависише протешшгаазн

2. сАМРсвязываюцие белки.

3. сАМРне зависимые протеинкиназы

4. Активность протеинкиназ в клеточном цикле

5. Активность протеинкиназ в трансформированной ткани молочной железы7.

ЗИЖШЯЕНТМШАЯ ЧАСТЬ

Материалы.
Методы.
1. Культивирование клеток асцитной карциномы Эрлиха
2. Фракционирование клеток асцитной карциномы Эрлиха методом седиментации в градиенте плотности сахарозы
3. Определение з фазы в клеточном цикле клеток Эрлиха
4. Выделение и фракционирование протеинкиназ
5. Определение активности протеинкиназ
6. Определение сАМРсвязыващей способности
7. Выделение ингибитора каталитической активности сАМРзависиыых протеинкиназ
8. Получение дефосфорилнрованного казеина.
9. Получение препаратов гистонов
. Определение молекулярного веса ферментов
методом гельфильтрацин.
. Определение концентрации белка.
. Приложение .А I. Инструкция по использованию биохимического набора для определения лротеинкиназной активности.
. Приложение В 2. Инструкция по использованию биохимического набора для определения сАЫРсвязывающей способности
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Общая характеристика множественных йоргл протеинкиназ клеток асцитной карциномы Эрлиха.
2. Свойства казеинкиназ меток асцитной карциномы Эрлиха
3. Динамика изменений протеинкиназной активности в ходе роста опухоли Эрлиха и в клеточном цикле
меток асцитной карциномы Эрлиха
ОБСУЕДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
I
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Среди многочисленных процессов, регуляция которых осуществляется при участии системы протеинфосфорилирования, процесс клеточной пролиферации и выяснение механизмов его регуляции занимают особое место. Понимание этих механизмов связано с решением таких актуальных на сегодняшний день проблем, как злокачественная трансформация, дифференцпровка, эмбриональное развитие. Епифанова п др. Нестерова и др. Несмотря на значительные успехи в изучении физикохимических и кинетических свойств протешпшназ, вопрос о их биологической роли и, в частности, о роли в регуляции процесса клеточной пролиферации остается открытым. Обзор тлеющейся по этой теме литературы показывает, что исследования закономерностей изменений протеинкиназной активности в клеточном цикле немногочисленны и ограничены достаточно узким кругом изучаемых объектов, что объясняется, в первую очередь, сложностью получения синхронизированных клеточных культур. В настоящей работе мы использовали в качестве объекта исследований клетки быстрорастущей перевиваемой на мышах асцитной опухоли молочной железы асцитной карциномы Эрлиха. Сравнительная простота поддержания культуры, а также возможность получения большого количества биоматериала, достаточного для проведения биохимического анализа, во многом способствовали выбору этого объекта. Применение метода фракционирования клеток в градиенте плотности сахарозы позволило быстро и в достаточных количествах получать клетки на различных стадиях митотического цикла. Еще одним важным свойством исследуемых клеток является их опухолевый характер, что позволяет говорить о закономерностях изменений протеинкиназной активности, связанных с опухолевым ростом. Эрлиха. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ I. Фосфорилирование белков представляет собой каталитический процесс, осуществляемый специфическими ферментат. АТРпротеин фосфотрансферазы КФ 2. Протеинкиназы катализируют перенос терминального фосфата АТР на различные акцепторы, главным образом, на гидроксильные группы серина и треонина белков. АНРзавпсимые протеинкиназы, найденные первоначально в скелетной мышце . Способность к стимуляции сАМР этих ферментов оказалась общим механизмом действия сАМР в клетках эукариот рис. I. Участие протеинкиназ в многочисленных клеточных процессах дало основание предположить, что они опосредуют все эффекты сАГ. , . Уникальная регуляторная роль сАМР, являющегося вторичныгл посредником при действии на клетки многочисленных гормонов , I0, большое количество важнейших процессов, находящихся под контролем системы циклонуклеотидов, таких как гликолиз . i . Епифанова и др. АМРзаьисимых протеинкиназ и механизмов их действия. Было показано, что сАМРзависимые протеинкиназы состоят из двух типов субъединиц регуляторной 5, которая связывает сАДР, и каталитической С, осуществляющей фосфорилированне белковсубстратов i, , . С субъединицы и способный диссоциировать под действием сЖР. В холоферменте активный центр каталитической субъединицы блокируется субъединицей. 22 АсАМР сАМР, Стехиометрия описанного процесса активации изучена в ряде работ i , , i . АМРзависимые протеинкиназы локализованы, главнш образом, в цитозольной фракции клеток . Однако, в тканях мозга и сердца обнаружена значительная доля мембранносвязанных протеинкиназ i . i . Более общей сШРзависимой протекшшназной активности локализовано во фракции мембран эритроцитов человека i . Было очищено и охарактеризовано две основных формы сАМРзависиглых протеинкиназ протеинкиназы I и П типов, согласно порядку их элюцпи с ДЭАЭцеллшозы i . Ссубъединицы протеинкиназ I и П типа функционально и структурно схожи и тлеют одинаковый молекулярный вес 0 , i , . Регуляторные субъединицы сАЫРзависимых протеинкиназ I и Ш отличаются иммунологически i . . При этом предполагается, что I не является протеолитическим фрагментом Ш . Рис. I. Ферменты системы , .