Механизм специфического отбора тРНК фенилаланил-тРНК-синтетазой: функциональная роль структурных элементов тРНК на различных стадиях взаимодействия

• Автор: Васильева, Инна Анатольевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 141 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Реакция аминоацилирования тРНК .

1.2. Два класса аминоацилтРНКсннтетаз.

1.3. Структура тРНК.

1.4. Общие закономерности и особенности высокоспецифичного взаимодействия аминоацилтРНКсинтетаз с тРНК методы выявления элементов идентичности в тРНК и исследования их функциональной роли.

1.4.1. I viv и i vi методы определения элементов специфичности

1.4.2. Распределение элементов узнавания в тРНК.

1.4.3. Относительный вклад элементов узнавания в кинетические параметры аминоацилирования

1.4.4. Аминоацилирование минитРНК субстратов ii и ii

1.4.5. Функциональная роль элементов узнавания в обеспечении специфичности на различных этапах взаимодействия.
1.4.6. Природа контактов, обеспечивающих специфичность взаимодействия
1.4.7. Динамика взаимодействия с тРНК .
1.4.8. Механизмы контроля продуктивного связывания ЗконцатРНК.
1.5. ФснилаланилтРНКсинтетаза структурнофункциональные особенности фермента н его взаимодействия с субстратами.
1.5.1. Общая характеристика структуры фермента
1.5.2. Взаимодействие фенилаланилтРНКсинтетазы с тРНКРЬс
1.5.3. Структурные основы каталитической функции фермента.
Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ .
2.1. Материалы.
2.2. Методы исследования.
2.2.1. Выделение плазмидных ДНК .
2.2.2. Гидролиз плазмидных ДНК эндонуклеазой рестрикции.
2.2.3. Синтез и выделение тРНКтранскриптов.
2.2.4.РМечение тРНК по 5концу. .
2.2.5. Ступенчатая деградация тРНК с Зконца.
2.2.6. УФиндуцируемая модификация мутантных тРНК1.
2.2.7. Частичный нуклсазный и щелочной гидролиз тРНК
2.2.8. Получение транскриптов тРНКрь, содержащих остаток на Зконцс, с использованием концевой СТРАТРтР1ПСнуклеотидилтралсферазы
2.2.9. Получение диальдегидных производных тРНКРЬс
2.2 Получение изамещенных аналогов тРНКРЬе с использованием ТА РНКлигазы.
2.2 Амнноацнлирование тРНК0, тРНКРЬстранскрипта и его фотоактивных аналогов и неспецифичных тРНК фенилаланилтРНКсинтетазой
2.2 Мечение фенилаланилтРНКсинтетазы фотореакционноспособными аналогами тРНКр,1е и разделение продуктов модификации
2.2 Аффинное мечение фенилаланилтРНКсинтетазы диаяьдегидпыми производными тРНКРЬе.
2.2 Нуклеазный гидролиз продуктов модификации фенилаланилтРНКсинтетазы
2.2 Определение констант диссоциации комплексов фенилаланилтРНКсинтетазы с тРНК .
2.2 Гельэлектофорез нуклеиновых кислот и белков
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Функциональная роль структурных элементов тРНК на различных стадиях взаимодействия с фенилаланнлтРНКсинтетазой
3.1. Эффективность распознавания тРНК фсннлаланилтРНКсинтстазой Т. i на стадии связывания.
3.1.1. тРНКРЬс . i эффективный субстрат фенилаланилтРНКсинтетазы Т. i в связывании
3.1.2. Исследование стабильности третичной структуры мутантных тРНКГЬе с нуклеотидными заменами в ом и ом положениях
3.1.3. Сравнение параметров связывания и аминоацнлирования мутантных тРЫУс м
3.1.4. Взаимодействие фенилатанилтРНКсинтетазы с неспецифичными тРНК.
3.1.5. Заключение к разделу 3.
3.2. Роль низкомолскулярных субстратов и элементов узнавания в продуктивном взаимодействии фенилаланилтРНКсинтетазы Т. i с акцепторным концом тРНКРЬе
3.2.1. Получение рсакционноспособных аналогов тРНКРЬс, исследование их субстратных свойств и аффинная модификация фенилаланилтРНК
синтетазы
3.2.2. Взаимодействие фенилаланилтРНКсинтетазы с акцепторным концом тРНК в присутствии низкомолскулярных субстратов.
3.2.2.1. Влияние и ЛТР на модификацию фенилаланилтРНКсинтетазы различными аналогами тРНК.
3.2.2.2. Роль низкомолекулярных субстратов в продуктивном связывании акцепторного конца тРНК
. Влияние нуклеотидных замен в тРНК на ориентацию акцепторного конца в комплексе с фснилаланилтРНКсинтстазой
3.3.1. Сравнительное исследование индуцируемой модификации фенилаланилтРНКсинтетазы аналогами тРНКРЬс, содержащими замены элементов
узнавания.
3.3.2. Роль элементов узнавания тРНКР1к в функциональной ориентации акцепторного конца
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Единственным исключением является существование двух типов со структурной топологией ого и ого классов ,. Деление на подклассы основано на структурном сходстве каталитических и некаталитических доменов и их композиции , . Ферменты класса I представители подклассов 1а и являются мономерами, подкласс 1с гомодимеры содержат две консервативные последовательности фНфФ iIi и , образующие нуклеотидсвязывающую складку Россмана активного центра рис. I, а. Синтетазы класса II обычно димеры или тетрамеры характеризуются тремя мотивами. Мотив 1, содержащий консервативный остаток пролина, участвует в образовании межсубъсдиничных контактов. Таблица 1. Консервативные мотивы фИфвй 1 фxxфxxфф 2 xx. Консервативные остатки обозначены большими буквами, строго консервативные жирным шрифтом ф гидрофобный остаток х любой остаток цепь переменной длины х. Мотивы 2 и 3, каждый из которых содержит консервативный остаток , формируют часть активного центра рис. Структурное различие классов проявляется в конформациях связанного нуклеотидного субстрата трифосфатная цепь АТР вытянута или изогнута в активном центре Iого или Iого классов, соответственно. Второе принципиальное различие между ферментами двух классов состоит в способах связывания акцепторной ветви тРНК. Синтетазы Iого класса взаимодействуют с акцепторным стеблем со стороны малой бороздки, при этом вариабельная петля экспонирована в раствор. Ферменты Иого класса связывают акцепторный стебель со стороны большой бороздки, и вариабельная петля контактирует с белком. ЗССАконец имеет шпилькоподобную структуру или вытянутую конформацию в комплексах синтетаз класса I и II, соответственно. Разделение синтетаз на два класса коррелирует с функциональным различием в стереохимии реакции аминоацилирования ферменты класса I присоединяют аминокислоту к 2, а ферменты класса II к ЗIIгруппе 3концевого аденозина тРНК. В настоящее время результаты рентгеноструктурных исследований комплексов аминоацилтРНКсинтетаз со специфичными тРНК в отсутствие или присутствии лигандов известны для шести представителей первого и восьми второго класса табл. Рнс. Структура активных центров представителей 1ого ОпВД, а и Ного классов АрК8, б. Показаны конформации ЛТР и Зконцевых последовательностей соответствующих тРНК в комплексах. Характерные структурные мотивы выделены разным цветом в соответствии с их обозначением. Рисунок воспроизводится из обзора . Рис. Связывание АТР аминоацилтРНКсинтетазами I , а и ого , б классов. Изображены основные остатки и ионы 2, взаимодействующие с субстратом. Водородные связи показаны зелеными линиями, а Остатки и принадлежат мотивам фНфСЬ и . Остатки входят в состав мотива 2, 6 мотива 3. Консервативные остатки 2 и 5 связывают каталитический ион 2. Рисунок воспроизводится из обзора . Таблица 2. АгБ, а . ИеЛБ, а . СпЯБ, а Е. ТугКБ, а2 . ТЬгБ, а2 . АБрЯБ, а2 . РИКис , . Ьу5ЯБ2, а2 , . Указан субъединичный состав исследованных ферментов данной специфичности. Использованы сокращенные названия организмов . Е. с. Для аналогов субстратов использованы следующие обозначения ТугОН, РгоОН тирозинол и пролинол АМРРсР и АМРсРР содержат СН2группу вместо или межфосфатного атома О в АТР V, , , и аналоги аминоациладенилатов, содержащие вместо фосфатной сульфамоильную группу I аминоалкиладенилат, полученный конденсацией аминоспирта с АМР. Структура комплекса с тРНК в отсутствие или в присутствии различных наборов лигандов. Источник тРНК указан для гетерологичных комплексов, в остальных случаях тРНК и фермент одинакового происхождения. Приведены последовательности антикодонов, различающиеся в тРНК разного происхождения или в изоакцепторных тРНК, где I инозин, 1Р псевдоурндин, 5метиламинометилуридин, кьюозин. Отмеченные тРНК синтезированы транскрипцией i vi. Структурные основы взаимодействия с низкомолскулярными субстратами АТР и аминокислотами изучены для большинства синтетаз механизмы катализа реакции активации являются общими внутри каждого класса , , . В то же время каждая система индивидуальна в способах связывания тРНК изза отсутствия общих тРНКсвязывающих мотивов.