Механизм связывания тиаминдифосфата с апотранскетолазной

• Автор: Оспанов, Руслан Ваитович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 112 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Кофакторы транскетолазы.

2. Взаимодействие тиа ми иди фосфата с апотранскетолазой

2.1 Двустадийный процесс взаимодействия тиаминдифосфата с апотранскетолазой

2.2 Изменение спектральных характеристик транскетолазы в результате ее взаимодействия с коферментом.

2.3 Кинетическая модель связывания кофермента с апотранскетолазой

2.4 Неэквивалентность активных центров в димере транскетолазы при связывании кофермента

2.5 Влияние субстратов на реконструкцию холотранскетолазы и ее стабильность.

3. Связывание субстратов с транскетолазой и их каталитические превращения

3.1 Изменение спектра холотранскетолазы в результате связывания и превращения субстратов.
3.2 Двусубстратная транскетолазная реакция.
3.3 Неэквивалентность активных центров транскетолазы по отношению к субстратудонору.
3.4 Односубстратная транскетолазная реакция
1. ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛИГАНДСВЯЗЫВАЮЩИХ ЦЕНТРОВ В ДИМЕРНОМ БЕЛКЕ.
1.1. Модель с эквивалентными и невзаимодействующими лигандсвязывающими центрами
1.1.1. Описание схемы двустадийного связывания тиаминдифосфата с транскетолазой.
1.1.2. Вывод теоретических уравнений.
1.2. Модель с взаимодействующими лигандсвязывающими центрами.
1.2.1. Описание схемы
1.2.2. Вывод теоретических уравнений.
1.2.3. Исследование модели с взаимодействующими лигандсвязывающими центрами
1.2.3.1. Построение графиков зависимостей степени насыщения белка лигандом У, степени конформационных изменений 7 и нормированной степени конформационных изменений 2орм от концентрации лиганда, Ь.
1.2.3.2. Построение трехмерного графика, связывающего степень насыщения белка лигандом У, нормированную степень конформационных изменений 2орм и концентрацию лиганда, 1.
1.2.3.3. Построение и анализ графиков зависимости нормированной степени конформационных изменений 2норм от степени насыщения белка лигандом У
1.3. Исследование кооперативных взаимодействий для
теоретических моделей
1.3.1. Модель Моно, Уаймена и Шанж
1.3.1.1. Описание модели
1.3.1.2. Сопоставление модели Моно, Уаймена, Шанже и разработанной нами модели с взаимодействующими лиганд
связывающими центрами
1.3.2. Модель Кошланда, Немети и Филмера.
1.3.2.1. Описание модели.
1.3.2.2. Сопоставление модели Кошланда, Немети, Филмера и разработанной нами модели с взаимодействующими лигандсвязывающими центрами
2. ВОЗМОЖНОСТЬ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ТЕОРЕТИЧЕСКИХ РАЗРАБОТОК НА ПРИМЕРЕ ТРАНСКЕТОЛАЗЫ
2.1. Выбор модели для изучения взаимодействия тиаминднфосфата с апотранскетолазой
2.1.1. Сравнение графиков остаточной разности
2.1.2. Коэффициент смешанной корреляции, как критерий выбора модели.
2.2. Расчет равновесных и кинетических констант при связывании тиаминднфосфата с апотранскетолазой в присутствии ионов М
2.2.1. Построение зависимости начальной скорости связывания тиамин дифосфата с апотранскетолазой от концентрации тиаминднфосфата и определение параметров v0д и К
2.2.2. Определение равновесных констант К и К
2.2.3. Определение констант скорости к, к.9 кг и к.2.
2.2.4. Построение графика зависимости нормированной степени конформационных изменений 7 от степени насыщения белка лигандом У для экспериментальных данных
2.2.5. Связывание тиаминдифосфата с транскетолазой в присутствии
субстратадонора
. Расчет равновесных и кинетических констант при связывании тиаминдифосфата с апотранскетолазой в присутствии ионов
2.3.1. Определение параметров у0,Прсд и К
2.3.2. Определение равновесных и кинетических констант
2.3.3. Построение графика зависимости нормированной степени конформационных изменений 7норм от степени насыщения белка лигандом У для экспериментальных данных.
2.3.4. Связывание тиаминдифосфата с транскетолазой в присутствии субстратадонора
3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
4. ВЫВОДЫ0
5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ТК транскетолаза ТДФ тиаминдифосфат
Г АФД глицеральдегид3фосфатдегидрогеназа
ГП гидроксипируват
КД круговой дихроизм
ДОЭТДФ дигидроксиэтилтиаминдифосфат
ФГА 3фосфоглицериновый альдегид
К5Ф ксилулозо5фосфат
Р5Ф рибозо5фосфат
С7Ф седогептулозо7фосфат Ф6Ф фруктозо6фосфат
ВВЕДЕНИЕ


Изменение спектральных характеристик транскетолазы в результате ее взаимодействия с коферментом. Влияние субстратов на реконструкцию холотранскетолазы и ее стабильность. Изменение спектра холотранскетолазы в результате связывания и превращения субстратов. Двусубстратная транскетолазная реакция. Неэквивалентность активных центров транскетолазы по отношению к субстратудонору. ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛИГАНДСВЯЗЫВАЮЩИХ ЦЕНТРОВ В ДИМЕРНОМ БЕЛКЕ. Описание схемы двустадийного связывания тиаминдифосфата с транскетолазой. Вывод теоретических уравнений. Модель с взаимодействующими лигандсвязывающими центрами. Вывод теоретических уравнений. Построение графиков зависимостей степени насыщения белка лигандом У, степени конформационных изменений 7 и нормированной степени конформационных изменений 2орм от концентрации лиганда, Ь. Построение трехмерного графика, связывающего степень насыщения белка лигандом У, нормированную степень конформационных изменений 2орм и концентрацию лиганда, 1. Модель Кошланда, Немети и Филмера. Описание модели. Коэффициент смешанной корреляции, как критерий выбора модели. Определение констант скорости к, к. Расчет равновесных и кинетических констант при связывании тиаминдифосфата с апотранскетолазой в присутствии ионов
2. Построение графика зависимости нормированной степени конформационных изменений 7норм от степени насыщения белка лигандом У для экспериментальных данных. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. Транскетолаза ТК, седогептулозо7фосфат Эглицеральдегид3фосфатгликольальдегидтрансфераза, КФ 2. Катализирует перенос дигидроксиэтильного остатка остатка гликольальдегида с кетозы на альдозу
С
НСО ТК нсо I I

С
неон

Я и Я могут быть представлены различными группами. Фермент характеризуется достаточно широкой субстратной специфичностью 4. За исключением последнего, у всех известных субстратовдоноров гидроксильные группы при Сз и С4 находятся в трансположении. Фосфорилированные субстраты имеют значительно более высокое сродство к ТК по сравнению с теми, у которых фосфатная группа отсутствует 4. Кофакторами ТК являются тиаминдифосфат ТДФ и ионы двухвалентных металлов, такие как Са2 и 2. Транскетолаза была обнаружена в г. В настоящее время наличие ее показано практически во всех исследованных тканях животного и растительного происхождения, а также у микроорганизмов. Фермент локализуется, преимущественно, в растворимой фракции клетки. Что касается объекта нашего исследования, ТК vii, то к настоящему времени определен ее аминокислотный состав и пространственная структура . Методами химической модификации , рентгеноструктурного анализа 9, и направленного мутагенеза идентифицированы аминокислотные остатки, необходимые для связывания ТДФ, субстратов и осуществления катализа. Имеется достаточно подробная информация, касающаяся оптических свойств фермента и их изменений при взаимодействии с транскетолазой различных лигандов 4, . Показано различное влияние двухвалентных катионов на связывание тиаминдифосфата с транскетолазой . Молекула ТК состоит из двух идентичных субъединиц и содержит два активных центра, образованных на границе между контактирующими поверхностями этих субъединиц. Молекулярная масса ТК составляет 8 кДа ,. Активные центры характеризуются одинаковой каталитической активностью. Каталитически активной единицей ТК является димер . Транскетолаза пекарских дрожжей первый тиаминдифосфатзависимый фермент, для которого в г. Помимо апо и холофермента, к настоящему времени, с помощью рентгеноструктурного анализа, проанализированы комплексы ТК с различными аналогами ТДФ , , с дигидроксиэтилтиаминдифосфатом интермедиатом транскетолазной реакции , и комплекс холоТК с субстратомакцептором эритрозо4фосфатом . Данные рентгеноструктурного анализа позволили охарактеризовать структуру активного центра фермента и дали толчок к более глубокому изучению механизма тиаминового катализа. Общие структуры этих тиаминдифосфатзависимых ферментов достаточно сильно различаются, однако область связывания кофакторов двухвалентных катионов и ТДФ имеет значительное сходство.