Лактатдегидрогеназа при старении эритроцитов

• Автор: Титова, Надежда Митрофановна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Красноярск
• Количество страниц: 180 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА I. ХАРАКТЕРИСТИКА ЛАКТАТДЕГИДГОГЕНАЗЫ II

1.1. Активный центр и механизм действия ЛДГ II

1.2. Изоферментный спектр ЛДГ

1.3. Кинетические свойства ДЦГ.

1.4. Физиологическая роль ДЦГ

ГЛАВА 2. НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ МЕТАБОЛИЗМА ЭРИТРОЦИТОВ

2.1. Особенности энергетического обмена ретикулоцитов и эритроцитов.

2.2. Лактат дегидрогеназ а эритроцитов.

2.3. Содержание и пути превращения НАД и НАДН в эритроцитах.

2.4. Лактат и пируват в эритроцитах
ЧАСТЬ II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЛАВА 3. МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЙ.
3.1. Фракционирование эритроцитов
3.2. Определение активности лактатдегидрэгеназы
3.3. Разделение изоферментов лактатдегидрогеназы
3.4. Определение содержания пирувата и лактата.
3.5. Определение содержания НАДН
3.6. Определение содержания НАД
3.7. Выделение изофердента ЛДГ1 из эритроцитов кролика.
3.8. Характеристика основных кинетических параметров и статистическая обработка результатов.
ГЛАВА 4. АКТИВНОСТЬ, КИНЕТИЧЕСКИЕ СЕОИСТВА И ИЗОИРМЕНГНЫЙ СПЕКТР ЛАКТАТДЕГЙДРОГЕНАЗЫ, СОДЕРЖАНИЕ НАД, НАДН, ПИРУВАТА И ЛАКТАТА ПРИ СТАРЕНИИ ЭРИТРОЦИТОВ, ПРОДУЦИРОВАННЫХ В УСЛОВИЯХ НОРМАЛЬНОГО ЗРИТРОПОЭЗА.
4.1. Активность и кинетические свойства ДЦГ.
4.2. Изоферментный спектр ДЦГ
4.3. Кинетические свойства изофермента ДЦГ
4.4. Содеркание НАД4, НАДН, пирувата и лактата в эритроцитах интактных кроликов.
ГЛАВА 5. АКТИВНОСТЬ, КИНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ИЗОФЕРМЕНТНЫЙ СПЕКТР ЛАКТАТДЕГЙДРОГЕНАЗЫ, СОДЕРЖАНИЕ НАД, НАДН, ПИРУВАТА И ЛАКТАТА ПРИ СТАРЕНИИ ЭРИТРОЦИТОВ, ПРОДУЦИРОВАННЫХ В УСЛОВИЯХ НАПРЯЖЕННОГО ЭРИТРОПОЭЗА.
5.1. Активность, кинетические свойства, изоферментный спектр ДЦГ, содержание НАД4, НАДН, пирувата и лактата во фракции молодых, старых эритроцитов и общей эритроцитарной массе на 7 день после кровопотери
5.1.1. Активность и кинетические свойства ДЦГ.
5.1.2. Изоферментный спектр ДЦГ.
5.1.3. Содержание НАД, НАДН, пирувата и лактата.
5.2. Активность, кинетические свойства, изоферментный спектр ДЦГ, содержание НАД4, НАДН, пирувата и лактата во фракции молодых, старых эритроцитов и общей эритроцитарной массе на
день после кровопотери.
5.2.1. Активность и кинетические свойства ДЦГ.
5.2.2. Изоферлентный спектр ДЦГ.
5.2.3. Содеркание НАД, НАДН, пирувата и лактата
5.3. Активность, кинетические свойства, изоферментный спектр ДЦГ, содержание НАД4, НАДН пирувата и лактата во фракции молодых, старых эритроцитов и общей эритроцитарной массе на день после кровопотери
5.3.1. Активность и кинетические свойства ДЦГ
5.3.2. Изоферментный спектр ДЦГ
5.3.3. Содеркание НАД4, НАДН, пирувата и лактата
ГЛАВА 6. ОБЩЕЕ ОЕСЩЦЕНИЕ
ВЫВОД.
ЛИТЕРАТУРА


За небольшим исключением все ДЦГ высших животных, согласно данным рентгеноструктурного анализа 2, 3, 8, ультрацентрифугирования 5, метода гибридизации 5, 6, 4, 7, химического анализа 2, 7, генетических исследований 5, имеют молекулярную массу приблизительно 0 кД и состоят из четырех субъединиц с молекулярной массой кД каждая. Ассоциация субъединиц приводит к образованию структуры с диэдральной симметрией , 5, 6. Каждая субъединица
надрезана щелью, на дне которой находится активный центр ферлента 2, 8, 6. Установлено, что отдельные субъединицы ДЩУ несущие на себе активный центр, не обладают каталитической активностью, активен только тетрамер лактатдегидрогеназы , 5, 2, 5, 6, 7. Реакция, катализируемая лактатдегидрогеназой, является двухсубстратной, идущей по упорядоченному механизму кофермент присоединяется к активному центру первым 8, 2, 1, 9 , 3. Спектрофотометрическое изучение двойных комплексов ДЦГ апоферленткоферлент показало, что каждая субъединица ферлента связывает одну молекулу НАД или НАДН , 5, 5, 6, 8. Это подтверждено результатами кристаллографического анализа, причем найдено, что молекула НАД в активном центре лактатдегидрогеназы имеет развернутую структуру , , , 4, 8, 8, 6, 5. Все четыре коферлент связывающих участка лактатдегидрогеназы независимы , . НАД и НАД конкурируют между собой за одни и те же участки полипептидной цепи субъединиц, связывание первого из них происходит в 0 раз сильнее, чем второго , . Для связывания кофермента полипептидная цепь субъединицы ДЦГ образует петлю,в которой размещается адениновый остаток коферлента рисЛ. В ориентации последнего принимают участие тирозин и особенно аспартат, который обеспечивает образование водородной связи с гидроксилом рибозы. При этом аспартат вместе с близлежащими аминокислотными остатками смещается на два ангстрема, обеспечивая образова
ние подходящей для коферлента полипептидной ниши. Рис. Активный центр лактатдегидрогеназы при связывании коферлента И субстрата ПО 8. Отрицательные заряды пирофосфатного участка коферлента компенсируются взаимодействием с гуанидиновой группой аргинина1. Конфорлационные перестройки в молекуле ферлента при образовании бинарного комплекса ДЦГНАД , , 8 , 4 усиливают взаимодействие субъединиц и приводят к формированию центра связывания субстрата. После образования бинарного комплекса ДЦГкоферлент к
активному центру присоединяется субстрат. Рентгеноструктурный анализ показал, что главную роль в присоединении субстрата играет взаимодействие его карбоксильной группы с гуанидиновой группой аргинина1 в ориентации субстрата также принимает участие аргинин9 , , 8. Каталитически активной группой в активном центре ЛДГ является имидазольная группа гистидина, находящаяся в положении 5 , , 1, 9, 8, 6, 9. Взаимодействие субстрата с функциональными группами активного центра лактатдегидрогеназы приведено на рис. Механизм катализа с участием ДЦГ можно представить следующим образом при образовании бинарного комплекса, например, ДЦГНАДН, происходит протонирование имидазольной группы гистидина5, на следующем этапе к этому комплексу присоединяется субстрат, пируват, в основном, благодаря взаимодействию его карбоксильной группы с гуанидиновой группой аргинина 1. Одновременно кетогруппа пирувата образует водородную связь с протокированным имидазолом гистидина5 и происходит изомеризация тройного комплекса апоферментНДЦНпируват в комплекс апоферментНАДлактат. Зтот процесс требует лишь переноса электронов, которому способствуют соответствующие конфорлационные изменения активного центра ДЦГ , , , , 8. После этого диссоциирует продукт реакции, а затем кофермент. Таким образом, если реакция идет по пути восстановления пирувата, то во время катализа образуется водородная связь между карбонильным кислородом субстрата и протонированным имидазолом гистидина5. Если же реакция идет по пути окисления лактата, то водородная связь образуется между атомом непротонированного азота гистидина5. Механизм действия лактатдегидрогеназы представлен на схеме рис. Рис. Механизм действия лактатдегидрогеназы по . Гистидин5 действует как кислотноосновной катализатор, стабилизирующий отрицательный заряд, который образуется на кислородном атоме пирувата, к способствует отщеплению протона от лактата при окислении.