Каталитические свойства глутамин (аспарагин) азы из Рseudomonas Aurantiаca BKM-548

• Автор: Кабанова, Елена Алексеевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 175 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений и обозначений .

ВВЕДЕНИЕ .

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА I. Общие сведения о глутаминаспарагиназах. .

1.1. Методы выделения и очистки глутамин аспарагиназ.II

1.2. Влияние физикохимических факторов на активность и стабильность дезамидаз . .

ГЛАВА 2. Исследования структуры дезамидаз

2.1. Молекулярная масса и субъединичное строение

2.2. Аминокислотный состав и первичная структура.

2.3. Функциональные группы активного центра

и их модификация.
ГЛАВА 3. Субстратная специфичность и ингибиторы
глутаминаспарагиназ
3.1. Реакции, катализируемые глутаминаспарагин азами
3.2. Константы Михаэлиса
3.3. Механизм действия.
3.4. Аффинные метки
3.5. Обратимые ингибиторы
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
ГЛАВА 4. Соединения, использованные в работе
4.1. Реактивы и их очистка .
4.2. Очистка глутамин аспарагин азы
стр.
а Источник выделения фермента
б Культивирование микроорганизма .
в Приготовление ацетонового порошка . .
г Выделение фермента
д Доказательство гомогенности фермента
с помощью дискэлектрофореза
ГЛАВА 5. Методы определения белка и активности
фермента
5.1. Определение белка
5.2. Определение активности с помощью реактива Несслера .
5.3. Определение активности с помощью глутаматдегидрогеназы .
5.4. Определение активности в реакциях гидролиза и синтеза гидроксаматов дикарбоновых аминокислот.
ГЛАВА 6. Исследование каталитических свойств
глутаминаспарагиназы
6.1. Субстратная специфичность
6.2. Влияние концентрации субстратов на скорость реакций гидролиза и гидроксиламинолиза
6.3. Влияние и температуры на активность и стабильность фермента
6.4. Действие 1глутамата на процесс тепловой инактивации фермента
6.5. Влияние катионов металлов и метаболитов на ферментативную активность. . .
6.6. Ингибирование фермента дикарбоновыми аминокислотами
6.7. Кинетика инактивации глутаминаспарагиназы под действием ДОН и азасерина. .
6.8. Влияние и температуры на инактивацию фермента под действием ДОН
6.9. Влияние лигандов на ингибирование фермента ДОН
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
ГЛАВА 7. Исследование оптимальных условий функционирования глутаминаспарагиназы
7.1. Влияние и температуры на активность и стабильность глутаминаспарагиназы
7.2. Регуляция активности глутаминаспарагин азы
а Влияние метаболитов на активность фермента .
б Влияние катионов металлов на активность фермента
ГЛАВА 8. Изучение взаимодействия фермента с эффекторами в условиях термоинактивации
8.1. Кинетика инактивации фермента при в присутствии ьглутамата .
8.2. Влияние структуры эффекторов на тепловую стабильность фермента
ГЛАВА 9. Субстратная специфичность глутаминаспарагин азы
9.1. Реакции гидролиза. Определение для ьглутамина и ь аспарагина
9.2. Трансферазные реакции .
9.3. Влияние на гидролиз и синтез гидроксамовых кислот
9.4. Зависимость скорости трансферазной реакции от концентрации субстратов . .

стр.
ГЛАВА . Исследование каталитических свойств
глутаминаспарагиназы методами ингибиторного анализа
.1. Влияние аналогов субстратов и продуктов на ферментативную активность
.2. Определение кинетики процесса ингибирования фермента ДОН и азасерином .
.3. Изучение взаимодействия фермента с аспартатом в условиях инактивации ДОН.
.4. Влияние структуры аналогов субстратов на инактивацию фермента
под действием ДОН.
.5. Влияние температуры и на ингибирование фермента ДОН
.6. Влияние органических кислот и их аналогов на взаимодействие фермента с ДОН
.7. Стабилизация фермента от инактивации при низких значениях . . .
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ВЫВОДЫ.Х
ЛИТЕРАТУРА


Однако широкое применение аспарагиназы в лечении онкологических заболеваний ограничено с одной стороны узким спектром противоопухолевой активности в основном она действует на лимфолейкозы, с другой стороны, развитием иммунитета и аллергий при многократном применении препарата из одного источника , . Решению этих проблем может способствовать расширение крута ферментов, используемых в онкологии. Так, было показано, что микробная глутаминаспарагиназа обладает мощным противоопухолевым действием ТОО, 4, 5, 4. В настоящее время этот фермент нашел применение в лечении опухолей человека 0, 5, . Лечебный эффект дезамидаз усиливается при комбинированной применении с другими химиотерапевтическими средствами , , 0, 1, 4, 3. С целью снижения иммунного ответа целостного организма и продления периода полужизни ферментов в плазме были проведены исследования по получению модифицированных и иммобилизованных форм дезамидаз , , , , , , 0, 0, 2, 9, 8, 1, 3,
. Все известные к настоящему времени глутаминаспарагиназы отностяся к ферментам микробного происхождения в отличие от собственно аспарагиназ и глутаминаз, которые, кроме того, содержатся в тканях животных и растений 2у. Обзор посвящен, главным образом, рассмотрению данных, касающихся структуры и функций глутаминаспарагиназ. К настоящему времени многие глутаминаспарагиназы получены в чистом гомогенном состоянии. К ним относятся ферменты ИЗ Ра. Р1иогеасепа АТСС 1 7 7 Рэ. Ра . Ас. Р 1иогезсеаз АГ 7, рв. А , рд. Рз. ЛАаса ВКМ8 , , Ра . Ъогеоро1ав 6 7. Удельная активность препаратов варьировала от до 5 едмг. В высокоочищенном состоянии получены ферменты ИЗ Рз . Ас. Ысиз , Ра. Лааса ИБФМ В 7, С. РгеипбИ б Ра. Пиогевсепа Г. При выделении глутаминаспарагиназ, как правило, микробные клетки разрушали путем замораживанияоттаивания и обработки ультразвуком. В отдельных случаях готовили ацетоновый порошок. Нуклеиновые кислоты удаляли с помощью хлористого марганца или протаминсульфата. При очистке фермента из Ас. Ысив использовали обработку РНКазой и ДНКазой. Для выделения глутаминаспа
ратиназ широко использовали фракционирование сульфатом аммония, хроматографию на катионо и анионообменниках и гельфильтрацию. При очистке ферментов из Рв. А и . ВКМ8 была проведена стадия тепловой обработки, а при очистке фермента из . Выход ферментов из различных источников колеблется от до . Влияние физикохимических факторов на свойства дезамидаз микроорганизмов было предметом пристального в. В таблице I представлены значения оптимальных для ряда ферментов, а также значения их изоэлектрических тозек. Видно, что большинство глутаминаспарагиназ наиболее активны в районе значений близких к физиологическим, причем оптимум аспарагиназной активности ферментов,как правило, сдвинут в область щелочных значений 8Ю по сравнению с оптимумом глутаминазной активности. Ноптимумы аспарагиназ и глутаминаз также во многих случаях находятся в нейтральной или слабощелочной зоне. Исключение составляют аспарагиназы ИЗ Дрожжей i И . АТ, глутаминаза из . А из . Показано,что глутаминаза А из . При выше 5,5 фермент находится преимущественно в форме, неспособной связывать субстрат. АТСС 2II . ГА . А . А . А 6,2 7I5I. Г I. Г . Г В . Сокращения ГА глутаминаспарагиназа А аспарагиназа АА аспарагиназа А АВ аспарагиназа В Г глутаминаза ГА глутаминаза А ГВ глутаминаза В. Изоэлектрические точки ферментов варьируют в довольно широких пределах. Для глутаминаспарагиназ характерны высокие значения изоэлектрической точки, за исключением фермента из Рв. А, имеющего изоэлектрическую точку 5. В то же время многие аспарагиназы имеют низкое значение изоэлектрической точки, в том числе аспарагиназа из е. Высокие значения р1 7,6 г 9,8 отличают аспарагиназы из . Значения гдутаминаз на примере двух ферментов находятся в области слабокислых значений. Данные по влиянию температуры на активность дезамидаз представлены в таблице 2. Следует отметить, что в литературе отсутствуют данные относительно влияния температуры на активность глутаминаспарагиназ. Температурный оптимум, который измеряли для некоторых аспарагиназ, довольно высок от до . Величины энергии активации дезамидаз колеблются от 2, до ккалмоль или ,3,4 кДжмоль.