Исследование реакций трансгликозилирования, катализируемых гликозидгидролазами экзо- и эндодействия

• Автор: Шишлянников, Сергей Михайлович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 115 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ.

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ГЛИКОЗИДГИДРОЛАЗЫ

1.1 Классификация гликозидгидролаз

1.2 Каталитический механизм гликозидгидролаз

1.3 Трансгликозилирование.

1.4. рОГалактозидаза

1.5. Ламинариназа и семейство гликозидгидролаз.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Ферменты

2.2 Физикохимические методы
2.3 Субстраты.
2.4 Измерение ферментативных активностей
2.5 Кинетические параметры изучаемых гликозидгидролаз.
2.6 Исследования трансгликозилирующей активности
изучаемых гликозидгидролаз
2.7. Характеристика структур продуктов трансгликозилирования методом ЯМР.
2.8. Характеристика структуры продуктов трансгликозилирования методом массспектрометрии
2.9. Метод определения показателей сродства позиций
связывания активного центра ламинариназы из Я. тагпт
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Физикохимические характеристики использованных в
работе ферментов.
3.2. Исследование гидролитической активности галактозидазы из iii .
3.3. Исследование трансгликозилирующей активности галактозиды из iii . в реакциях с использованием i .
3.3. Структура продуктов реакции трансгликозилирования с участием в качестве субстратов и
3.5. Эндогликозидгидролазы в ферментативном синтезе модифицированных Рглкжоолигосахаридов.
3.5. Использование модифицированных р1,3глкжолигосахаридов для измерения активности и картирования активного центра ламинариназы из i.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Углеводы биомолекулы, стоящие в одном ряду по биологической значимости вместе с белками, липидами и нуклеиновыми кислотами. В последние несколько лет показано, что олигосахариды выполняют не только роль энергетического источника и структурной компоненты клетки, но обладают и другими ключевыми биологическими функциями Р. , . Присутствие углеводных единиц в различных биологических структурах влияет на их физические, химические и биологические свойства. Широкое разнообразие углеводных компонент в гликопротеинах отражает их функциональное многообразие. Например, в качестве маркеров в межклеточном взаимодействии О и гликозилированные лектины обуславливают вирулентность от микроорганизмов , . i, . i. , . А. i, . I. i, . Vi, А. , Р. М. i, . К тому же так называемое правильное гликозилирование белков имеет важное значение в процессе их экспрессии и укладки Ii, А. , . . i, . i, . i, . , . , Р. . . Существенна роль гликоконыогатов и в медицине. Н, X, i . Большинство биологически важных гликоконьюгатов олигосахариды, гликопротеины и гликолипиды и их производные трудно получить в больших количествах из природных источников. Синтез различных олигосахаридов и углеводных компонент гликоконьюгатов может быть выполнен химически или ферментативно. Химические методы синтеза предполагают использование реакций блокирования и деблокирования реакционноспособных групп, что приводит к трудоемким и дорогостоящим многостадийном процессам К. Ii . В результате, синтез олигосахаридов с длиной цепи более 3 гликозидных остатков является экономически невыгодным. Альтернативным решением этой проблемы остается ферментативный синтез с использованием ферментов, способных катализировать перенос гликозильных групп i, . iv, 4. Такой способностью обладают две группы ферментов гликозилтрансферазы К. Ф 2. Х. и гликозидгидролазы К. Ф. З. I viv гликозидтрансферазы осуществляют образование гликозидной связи с высокой региосслсктивностью. Однако существенным недостатком гликозидтрансфераз является их относительно низкая стабильность и необходимость в использовании i vi в большом количестве дорогих кофакторов например, уридин дифосфат. V. . . i , . В представленной работе, на примере трех гликозидгидролаз фгалактозидаза из iii . vi ламинариназа i ii, обладающих трансгликозилирующей активностью, продемонстрированы различные стратегии получения олигосахиродов с высокой региоселективностью и высоким выходом. Полученные данные о способности ферментов к проведению трансгликозилирующей реакции и строении их активных центров дают возможность не только эффективно использовать гликозидгидролазы в энзиматическом синтезе, но и получать новую информацию о механизме действия гликозидгидролаз в целом. Выделить и очистить до гомогенного состояния следующие гликозидгидролазы, обладающие трансглкозилирующей активностью ргалактозидазу из iii . Р1. vi . Р1. i ii ферменты эндодействия. Исследовать трансгликозилирующие активности изучаемых ргалактозидазы и р1. ЯМР и массспектрометрии. Изучить влияние синтетических субстратов, в том числе, 10ацетилрОгалактопиранозида на выход продуктов реакций трансгликозилирования, катализируемых ргалактозидазой из iii . Использовать реакцию трансгликозилирования, катализируемую ламинариназами, для получения новых флуорофорных и хромофорных субстратов, необходимых для изучения кинетических параметров эндоглюканаз, в частности, ламинариназы из i. В настоящей работе впервые установлено, что ргалактозидаза из iii . Показано, что впервые синтезированное соединение 10ацстилргалактопиранозид является субстратом для реакций гидролиза и трансгликозилирования, катализируемых ргалактозидазой, более эффективным по сравнению с другими субстратами.